目的：　　在世界范围内，特别是亚洲地区，胃癌是恶性肿瘤致死的主要原因之一。多数患者在诊断时已经是进展期或发生转移，目前的化学治疗药物对进展期胃癌的治疗效果并不尽如人意，如毒副作用大，易产生耐药等。蟾蜍灵(Bufalin)是从中华大蟾蜍和黑蟾蜍的皮脂腺分泌的传统中药蟾酥中分离提取的蟾毒配基之一。目前的研究表明，Bufalin存在显著的抗肿瘤活性，能够诱导多种肿瘤细胞凋亡、抑制增殖，包括肺癌、乳腺癌、肝癌、白血病和胃癌等，但其毒副作用与化疗药物相比要小的多。而我们的发现提示并不是所有的胃癌细胞都对其敏感，不同胃癌细胞表现出对Bufalin敏感性的差异显著，在肝癌中也有类似的报道但具体机制不清。　　富含半胱氨酸的酸性蛋白(Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine，SPARC)是一种分泌蛋白，它的生理功能与组织细胞生长发育、组织细胞重塑和修复有关。近来研究显示SPARC参与肿瘤的发生、侵袭、转移、血管新生及炎症反应等。可通过调控细胞周期、凋亡及生存通路等途径参与影响多种肿瘤细胞对药物的敏感性。我们发现在对Bufalin的敏感性存在显著差异的不同胃癌细胞系SPARC的表达也存在明显不同，相比之下高表达SPARC的胃癌细胞对Bufalin不敏感。同时SPRAC参与调控的这些细胞周期、凋亡及生存通路中的相关蛋白在Bufalin发挥抗肿瘤的作用机制中也起到了非常重要的作用，如Bax、Bcl-2及PI3K/Akt等。　　因此，为了分析胃癌细胞中SPARC与Bufalin敏感性的关系，我们选择了不同SPARC表达的胃癌细胞系，包括高表达的SGC7901和低表达的MGC803、BGC823并于高表达的SGC7901瞬时敲除SPARC来对SPARC在Bufalin诱导胃癌细胞凋亡、细胞周期阻滞及生存通路抑制等多个环节中的调节作用进行了研究。　　另外，许多肿瘤中SPARC表达增高，如恶黑、胶质瘤、乳腺、消化及泌尿系统肿瘤等。既往研究显示SPARC蛋白在胃癌组织中的表达情况比较复杂:包括胃癌细胞胞浆表达，组织间质细胞表达或二者均有表达。间质SPARC表达和肿瘤分化程度、临床分期、淋巴结转移正相关，临床研究显示在胃癌中SPARC可能作为预后不良的预测分子，然而也有报道发现其与预后无关。　　SPARC蛋白可能参与调节某些抗肿瘤药物的药物敏感性，如SPARC与白蛋白亲和力高，乳腺癌和胰腺癌Ⅱ、Ⅲ期临床试验证实应用白蛋白结合紫杉醇效果较普通紫杉醇好，与二者肿瘤SPARC表达高能够富集抗肿瘤药物有关。紫杉醇在晚期胃癌中也有效，因此明确胃癌中SPARC的表达情况非常重要，我们利用免疫组织化学染色技术(immunohistochemistry，IHC)检测了137例胃癌患者SPARC的表达情况，提示胃癌间质SPARC高表达，且进一步分析了肿瘤间质SPARC的表达与临床预后及临床病理特征间的关系。　　材料与方法：　　1、采用MTT法测定细胞活力。　　2、采用流式细胞仪通过PI单染，进行细胞凋亡的判断及细胞周期的测定。　　3、采用流式细胞仪通过DiOC6染色进行线粒体跨膜电位的测定。　　4、采用Western blot检测Caspase-3，PARP，Bax，Bcl-2，Cyto-c，CyclinA，CyclinB，CyclinE，Cdk2，Akt，ERK，Src等蛋白的表达。　　5、采用PCR技术检测SPARC的mRNA表达情况。　　6、采用Lipofectamine2000试剂进行瞬时转染。　　7、免疫组化染色检测胃癌组织标本中SPARC表达情况。　　8、统计学处理:每次实验重复3次，数据以(x)±s表示，两组间差异采用Students t test分析。采用Spearman秩和相关分析分析各参数相关性，生存分析采用Kaplan-Meier(KM)法，组间比较采用log-rank检验。风险评估采用单因素和多因素Cox比例风险模型。P＜0.05有统计学意义。　　实验结果：　　1、在MGC803，BGC823，SGC7901和MKN45四种胃癌细胞中，SGC7901细胞中SPARC表达相对于其他3种细胞系为高表达。高表达SPARC的SGC7901细胞和低表达SPARC的MGC803、BGC823细胞对Bufalin的敏感性存在显著差异。MGC803细胞和BGC823细胞24 h、48 h抑制细胞增殖50％的Bufalin药物浓度(IC50)是160.0±0.87 nmol/L,223.9±14.14 nmol/L和66.1±8.59 nmol/L,148.1±23.26 nmol/L而SGC7901细胞则至少是它们的5倍以上，细胞增殖抑制不明显。另外，SGC7901细胞在200 nmol/L的Bufalin作用24 h后，较MGC803细胞和BGC823细胞并不能引起明显的细胞凋亡(6.03±2.85％vs21.63±1.76％.16.87±9.31％)。而在高表达SPARC的SGC7901细胞中瞬时敲除SPARC后，可以见到其对Bufalin的IC50降至159.1±1.60 nmol/L，出现明显的细胞增殖抑制，同时凋亡比例从7.02±2.12％升至23.42±0.60％，说明在胃癌细胞中SPARC蛋白与Bufalin的敏感性有关，可抑制其诱导的胃癌细胞凋亡。　　2、与SPARC高表达的SGC7901细胞相比，200 nmol/L Bufalin作用于SPARC低表达的MGC803细胞24 h可引起明显的细胞凋亡，可以观察到更明显的凋亡蛋白Caspase-3和PARP的裂解，早期线粒体跨膜电位(△ψ M)的下降及线粒体通路蛋白变化:Bcl-2/Bax表达下调，细胞色素C(Cyto-c)胞浆释放增加。而高表达的SGC7901则无明显变化。当瞬时敲除SPARC后SGC7901细胞在200 nmol/LBufalin作用下增加了Caspase-3和PARP的裂解，出现早期线粒体跨膜电位(△ψM)的下降及线粒体通路蛋白变化:Bcl-2/Bax表达下调，细胞色素C(Cyto-c)胞浆释放增加。　　3、200 nmol/L Bufalin作用6h可以诱导MGC803细胞出现G2/M期阻滞:G2/M期比例从34.59％提高到56.16％，伴随着细胞周期蛋白CyclinB和CyclinA的下调（CyclinE和Cdk2无变化）。而SPARC高表达的SGC7901细胞则无明显阻滞，G2/M期比例仅从38.19％提高到44.05％，且细胞周期蛋白表达水平也没有明显变化。当敲除SPARC后SGC7901细胞经过相同浓度的Bufalin处理，可出现G2/M期阻滞(60.07％ vs43.19％)且同样出现了CyclinB和CyclinA蛋白表达减少，与低表达SPARC的MGC803相似。SGC7901细胞给予100、200 nmol/L Bufalin孵育24 h后其Akt, ERK，Src明显活化。当敲除SPARC后Akt，Src磷酸化表达水平明显下调，而ERK无明显变化，提示SPARC对Bufalin诱导的细胞周期阻滞作用的抑制和对生存通路的部分活化可能与胃癌细胞对Bufalin的敏感性有关。　　4、137例患者胃癌组织中间质阳性表达84例(84/137，61.3％)临床病理特征与SPARC有关的仅有分化程度，即低分化组SPARC阳性率高(P=0.004)，而与患者性别、年龄、手术操作、疾病定位、侵袭深度及淋巴结转移、血行转移和术后TNM分期等无关。经Kaplan-Meier生存曲线分析，胃癌间质SPARC阳性表达提示预后不良，COX风险比例模型进行单因素分析显示T分期、N分期、TNM分期及胃癌间质SPARC阳性表达均与OS有关(P=0.007，0.001，＜0.001，0.034)。进一步行多因素分析提示胃癌SPARC是独立预后因素(P=0.022，HR=1.446)。　　结论：　　1.SPARC能抑制Bufalin诱导的胃癌细胞凋亡。　　2.SPARC能通过抑制线粒体通路来抑制Bufalin诱导的胃癌细胞凋亡。　　3.SPARC能够抑制Bufalin诱导的胃癌细胞的G2/M期阻滞，增强了Bufalin耐药细胞生存通路Src，Akt的活化，非ERK通路。　　4.胃癌间质SPARC阳性表达与胃癌分化程度正相关，是独立预后因素，提示预后不良。