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L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸,广泛应用于医药、食品、化妆品以及饲料工业.从土壤筛选获得了一株假单胞菌TS1138,可转化DL-ATC合成L-半胱氨酸.该研究从菌株鉴定、产物的鉴别、产酶及酶促反应条件、关键酶的分离纯化、酶学性质以及转化酶基因的克隆和表达等方面进行了研究,研究结果如下:从富含DL-ATC的环境中筛选到一株可转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的菌株TS1138,利用形态学特征、生理生化特征、G+Cmol﹪、16SrDNA序列同源性对TS1138菌株进行了初步分类鉴定,结果表明该菌株可能属于恶臭假单胞菌能够利用DL-ATC转化合成L-半胱氨酸的一个亚种.将酶法转化生成的产物氧化后利用阳离子交换树脂进行了分离纯化,得到L-胱氨酸结晶.酶促反应后的产物经比旋光度、DTNB对巯基的特异性反应、Rf值、紫外扫描图谱以及高效液相色谱进行检测后为L-半胱氨酸.建立了最佳酶促反应条件:完整细胞酶液(细胞培养液5倍浓缩)在43℃、pH8.0、DL-ATC底物浓度6g/L时,进行酶促反应时转化率最高达到59.9﹪;超声波破壁后酶液(5倍浓缩)在37℃、pH8.0、DL-ATC底物浓度为6g/L时进行酶促反应时转化率最高达到79.1﹪.以pBluescript SKⅡ为载体,以大肠杆菌DH5α为受体菌,构建了TS1138菌株的基因组DNA鸟枪法随机文库,检验证明文库具有较好的完整性和代表性.然后以大肠杆菌w3110cysB<->为受体菌重新构建TS1138菌株的基因组DNA的随机文库,并建立特异性的筛选模型,从文库中筛选到一株可转化DL-ATC为L-半胱氨酸的重组菌株.针对ORF1构建两个重组质粒pET21a-ORFb和pBlue-ORFb;针对ORF2构建两个重组质粒和pBlue-ORFc和pET21a-ORFc.将重组质粒pET21a-ORFb、pET21a-ORFc分别转化大肠杆菌BL21,经诱导后发现重组质粒中的ORF1和ORF2均能够得到很好地表达;将重组质粒pBlue-ORFb和pBlue-ORFc分别转化大肠杆菌DH5α,经诱导后发现ORF1的表达产物可以催化L-ATC合成L-SCC,ORF2的表达产物可以催化L-SCC合成L-半胱氨酸.由此说明ORF1编码的产物为L-ATC水解酶,ORF2编码的产物为L-SCC酰胺水解酶.在分子水平上证明了在TS1138菌株中,从DL-ATC酶法转化合成L-半胱氨酸经S-代的途径进行.与日本Shiba和Ohmachi报道的假单胞菌BS和ON-4a菌株从DL-ATC酶法转化合成L-半胱氨酸N-代途径关键酶的基因均有明显差异.