类风湿关节炎（RA）是一种累及全身系统的慢性自身免疫病,临床表现为小关节的局部肿胀疼痛,功能障碍等,成纤维样滑膜细胞（FLS）异常增殖、活化导致软骨和骨组织的破坏是RA的关键病理特征。在正常人的关节中,滑膜内膜中的FLS产生透明质酸和润滑素等关节润滑剂,发挥润滑和保护关节的作用,而在RA患者关节中,FLS通过生成大量基质金属蛋白酶（MMP）来破坏软骨和非骨质支撑结构,以及通过促进破骨细胞生成和抑制骨修复来促进骨侵蚀。因此,抑制FLS的异常增殖和恢复其正常功能是治疗RA的有效策略。环磷酸腺苷（cAMP）是一种细胞内主要的第二信使,在调控细胞增殖方面发挥重要作用。在生理状态下,FLS胞膜上表达多种偶联Gαs的G蛋白偶联受体（GPCRs）,肾上腺素、前列腺素E2（PGE2）、腺苷等配体适度激活相应的GPCRs,使细胞内存有一定丰度的cAMP,激活下游的PKA,促进细胞周期抑制相关蛋白的表达,减弱促进细胞增殖的细胞外调节蛋白激酶（ERK）和细胞周期蛋白D1/D3活性,使FLS处于增殖静止状态。课题组前期研究发现,RA时,循环和关节局部肾上腺素和PGE2等配体病理性升高,使FLS上的GPCRs在GRK2和β-抑制蛋白2协同作用下发生脱敏和内吞,受体功能被负调,致使FLS中cAMP的水平降低。同时也有文献报道,在炎性FLS内表达大量的磷酸二酯酶（PDE）,PDE能够高效水解cAMP,使得FLS内cAMP的含量进一步降低,也是导致FLS类肿瘤样异常增殖的重要机制。磷酸二酯酶（PDE）是一种能够水解细胞内cAMP/c GMP的超家族酶。PDE总共有11种亚型（PDE1～11）,并且根据其水解底物的特异性可以分成:特异性水解cAMP（PDE4、PDE7、PDE8家族）、特异性水解c GMP（PDE5、PDE6、PDE9家族）以及水解cAMP/c GMP（PDE1、PDE2、PDE3、PDE10、PDE11）家族。有文献报道,在RA FLS中PDE4亚型表达水平显著升高。体外用肿瘤坏死因子-α刺激（TNF-α）可诱导FLS大量表达PDE4D,使用PDE4抑制剂Apremilast可显著抑制胶原抗体诱导的关节炎（CAIA）小鼠足爪肿胀、关节炎指数,延缓关节炎的发作,并改善关节病理,提示,PDE4D高表达是FLS异常增殖和关节炎症发生的重要病理因素,但FLS中PDE4D高表达的病理机制尚不清楚。虽然目前临床上已有PDE4抑制剂用于治疗哮喘、慢性阻塞性肺疾病等,但由于不良反应严重并持久,限制了其临床应用,特别是慢性病的治疗使患者难以耐受。因此,揭示炎症状态下FLS中PDE4D表达增高的分子机制,减少其异常高表达是治疗RA的安全和有效策略。课题组前期大量研究发现,TNF-α作用可减少FLS中cAMP含量,且与GRK2相关,进一步发现,TNF-α刺激正常人FLS,可通过肿瘤坏死因子受体2（TNFR2）和肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF2）活化GRK2,然而,TNF-α是否通过激活GRK2,上调PDE4D的表达,因而导致FLS中cAMP降低的尚不清楚。课题组预实验显示,TNF-α体外刺激可诱导大鼠FLS中表达大量PDE4D,利用小干扰RNA（siRNA）抑制GRK2表达可显著抑制TNF-α诱导的PDE4D生成,提示GRK2确实参与了炎性FLS中PDE4D的合成过程。现有研究表明,GRK2除了负调GPCRs外,可介导多种下游信号通路,影响蛋白的表达和细胞功能变化,包括c-Jun氨基末端蛋白激酶（JNK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B以及核转录因子κB（NF-κB）信号等,GRK2通过何条信号通路升高PDE4D表达的有待阐明。本课题在前期研究结果和文献报道的基础上,检测PDE4D在RA患者和CIA大鼠FLS中以及TNF-α诱导的正常FLS中表达情况;利用转染GRK2 siRNA的大鼠FLS和GRK2+/-小鼠建立的CAIA模型,探究GRK2在炎性FLS中PDE4D高表达及细胞异常增殖中的作用;利用信号分子活性抑制剂阐明GRK2参与炎性FLS中PDE4D合成的分子机制;给予GRK2抑制剂CP-25或帕罗西汀（Par）治疗CIA大鼠,观察整体指标,进一步检测GRK2抑制剂对FLS中PDE4D水平和相关信号转导的影响,揭示其治疗CIA的药理作用机制。本研究为完善RA FLS异常增殖的病理机制学说以及阐明GRK2抑制剂治疗实验性关节炎的作用机理提供实验依据。目的:观察炎性FLS中PDE4D的表达水平及对细胞增殖的影响;阐明GRK2在炎性FLS高表达PDE4D,减少细胞内cAMP含量,引起细胞异常增殖中的作用及分子机制;揭示GRK2抑制剂通过减少FLS中PDE4D的表达,抑制炎性FLS异常增殖的药理作用及其机理。方法:为揭示炎性FLS中PDE4D的表达水平及对细胞增殖的影响,采用q RT-PCR及Western blot法,检测RA患者和CIA大鼠FLS中PDE4D的mRNA及蛋白表达水平,采用PDE4D选择性抑制剂BPN14770预处理细胞,高内涵细胞成像系统检测TNF-α刺激的FLS增殖情况;为阐明GRK2在炎性FLS高表达PDE4D,减少细胞内cAMP含量,引起细胞异常增殖中的作用,采用TNF-α刺激FLS,Western blot法检测GRK2和PDE4D的表达水平,使用siRNA沉默GRK2基因或GRK2抑制剂处理TNF-α刺激的正常大鼠FLS,采用人的FLS转染质粒过表达GRK2基因,Western blot法检测GRK2和PDE4D的表达情况,高内涵细胞成像系统检测FLS增殖情况,荧光共振能量转移技术检测FLS中cAMP含量的变化。以GRK2+/-小鼠建立CAIA模型并与WT小鼠模型进行关节炎整体评分比较,免疫荧光法观察滑膜组织PDE4D的表达情况,H＆E染色显示关节FLS增殖情况。为探究GRK2在炎性FLS中导致PDE4D高表达的分子机制,在TNF-α刺激正常大鼠FLS条件上,分别给与GRK2介导主要下游通路的抑制剂进行预处理,Western Blot检查PDE4D表达情况。为揭示GRK2抑制剂是否通过减少FLS中PDE4D表达,抑制炎性FLS异常增殖,改善实验性关节炎,建立大鼠CIA模型,给予CP-25（50 mg/kg/d）、Par（15 mg/kg/d）或甲氨蝶呤（MTX）（0.5mg/kg/3d）治疗21天,记录关节炎整体指标,H＆E染色评价关节病理改变,Western blot法检测各组大鼠滑膜组织中GRK2、p65和ERK的表达和活性以及PDE4D的表达水平。结果:1.PDE4D在RA患者和CIA大鼠FLS中表达显著升高且和CIA大鼠FLS异常增殖显著正相关。在造模d29,大鼠CIA达到炎症高峰期时取出滑膜组织,组织块贴壁法培育FLS。与正常大鼠FLS相比,CIA大鼠FLS中PDE4D基因和蛋白的表达显著升高,同时CIA大鼠踝关节组织FLS的标志物Vimenten表达增多,伴有PDE4D的平均荧光强度（MFI）升高,且PDE4D的MFI与Vimenten表达呈正相关性。在符合伦理和知情同意的前提下采集正常和RA患者滑膜组织,组织块贴壁法培育FLS,与正常人FLS相比,RA患者FLS中PDE4D蛋白表达含量显著上升。提示,PDE4D在RA患者和CIA大鼠FLS中表达显著升高可能与FLS异常增殖有关。2.PDE4D在TNF-α体外刺激促进大鼠FLS异常增殖中发挥重要作用体外用TNF-α刺激正常大鼠FLS可显著升高细胞中PDE4D基因和蛋白表达,并诱导FLS大量增殖,相关性分析显示,TNF-α作用下细胞内PDE4D的MFI与细胞数量呈正相关。进一步研究发现,TNF-α慢性作用使大鼠FLS在腺苷酸环化酶激动剂Foskolin（Fsk）作用下产生cAMP减少,广谱PDE抑制剂IBMX可恢复Fsk产生cAMP的能力,提示,经过TNF-α长期刺激,细胞内的PDE不仅表达升高,活性也显著增强,明显抑制细胞内cAMP的产生。PDE4D抑制剂BPN14470预处理显著抑制TNF-α体外对正常大鼠FLS的促增殖作用。提示,PDE4D活性增强,降低细胞内cAMP产生能力,是TNF-α诱导FLS异常增殖的重要原因之一。3.TNF-α通过GRK2诱导正常大鼠FLS中PDE4D高表达通过Western blot法检测发现,TNF-α诱导大鼠FLS中GRK2高表达。采用siRNA沉默大鼠FLS中GRK2的表达,或者用GRK2抑制剂CP-25或Par抑制GRK2的活性,可抑制TNF-α刺激下大鼠FLS中PDE4D的表达。在正常人的FLS中转染GRK2质粒,过表达GRK2可升高细胞内PDE4D的表达。进一步研究发现,TNF-α慢性作用可减弱前列腺素E2（PGE2）刺激大鼠FLS产生cAMP的能力,这一抑制作用可被GRK2抑制剂CP-25预处理有效恢复。且GRK2抑制剂CP-25或Par能够显著抑制TNF-α诱导的FLS增殖。提示,TNF-α通过GRK2诱导大鼠FLS中PDE4D高表达,降低FLS内cAMP水平产生水平,从而介导FLS的异常增殖。4.TNF-α可能通过GRK2所介导的NF-κB和ERK通路促进大鼠FLS中PDE4D的表达用TNF-α刺激正常大鼠的FLS的同时,给与NF-κB p65抑制剂JSH-23、JNK抑制剂Bentamapimod、ERK抑制剂Ravoxertinib、P38MAPK抑制剂Doramapimod、PI3K抑制剂NVP-BAG956或CP-25,检测各组细胞中PDE4D的表达,结果显示,与刺激组相比较,抑制NF-κB p65、ERK或p38 MAPK信号通路均能不同程度抑制PDE4D的表达且具有统计学差异。进一步用siRNA沉默大鼠FLS中GRK2,给与TNF-α刺激,发现减少GRK2表达可降低TNF-α诱导的NF-κB p65和ERK活性,而p38MAPK活性未被明显影响。提示,TNF-α可通过GRK2介导NF-κB和ERK通路促进大鼠FLS中PDE4D的表达。5.杂合敲除GRK2减少CAIA小鼠FLS中PDE4D表达并缓解关节炎症建立GRK2杂合敲除(GRK2+/-)小鼠CAIA模型,与同窝野生型（wild type,WT）小鼠CAIA模型进行对比,关节炎指数明显减低,只出现轻微关节病理的改变,提示从基因层面减少GRK2整体表达能够显著改善CAIA小鼠关节炎。且GRK2+/-CAIA小鼠关节中PDE4D的MFI较WT CAIA组明显降低,提示体内敲除部分GRK2即能够明显减少CAIA小鼠踝关节FLS中PDE4D的表达,改善关节炎,因此介导FLS中PDE4D的上调可能是GRK2发挥促炎作用的重要途径。6.GRK2抑制剂可减少FLS中PDE4D的表达,有效改善大鼠CIA建立CIA大鼠模型,并给予Par、CP-25或MTX治疗CIA大鼠。结果显示,各给药组可不同程度改善CIA大鼠的全身评分、关节炎指数、关节炎肿胀数和继发侧足爪容积,恢复胸腺和脾脏指数,减轻关节病理改变,对大鼠CIA具有明确的治疗作用。检测发现,GRK2抑制剂显著抑制CIA大鼠滑膜组织中GRK2、NF-κB p65和ERK的活性以及PDE4D的表达。提示,降低NF-κB p65和ERK介导的PDE4D表达可能是GRK2抑制剂有效治疗实验性关节炎的重要药理作用之一。结论:1.TNF-α通过上调GRK2,激活NF-κB和ERK通路,导致PDE4D表达增多,抑制细胞内cAMP产生,促进FLS异常增殖;2.GRK2抑制剂通过减少NF-κB和ERK通路介导的PDE4D表达,抑制FLS过度增殖,改善大鼠CIA。