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目的先前的研究表明肺癌细胞株及肺癌组织中HnRNP B1的表达明显增高，并可能是肺癌的早期分子标志。然而HnRNP B1在肺癌发病中的分子机制尚未完全明了。本研究构建HnRNPB1特异性的siRNA真核细胞表达载体并转染人肺癌细胞株A549，了解重组载体对A549细胞HnRNPB1基因的干扰效果以及对肺癌细胞生长增殖、细胞周期及凋亡的影响，进一步探讨HnRNPB1基因在肺癌发生发展中的作用，并为RNA干扰（RNAi）分子靶向基因治疗肺癌提供一种新的手段和理论基础。方法1．利用计算机辅助设计软件，根据GenBank数据库提供的HnRNP B1基因核苷酸序列，按照Tuschl设计原则，在HnRNPB1序列中选取AAAACTTTAGAAACTGTTCCT（7一27）、AACAGTTCCGTAAGCTCTTTA（52一72）、AAGCTGTTTGTTGGCGGAATT（336一356）、AAAGGCTTTGTCTAGACAAGA（554一574）4段作为靶序列，设计4对双链小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），再转化为能表达其小发卡结构RNA（Small hairpin RNAs，shRNA）的4对DNA序列，并与psiRNA质粒定向连接，构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子Hl的真核表达载体，得到HnRNP B1特异性siRNA的4对重组质粒，分别命名为A，B，C，D，经PCR和DNA测序进行鉴定。2．采用脂质体Lipofectamine 2000瞬时转染A549细胞24小时，RT-PCR检测HnRNP B1 mRNA的表达。在瞬时转染的基础上，利用该载体带有的药物抗性筛选系统进行稳定转染，筛选出阳性A549细胞克隆，以荧光定量RT-PCR检测不同时间点转染前后HnRNP B1 mRNA表达的变化、western blot检测转染前后HnRNP B1蛋白表达的变化。3．采用MTT法检测重组质粒A，B，C，D转染A549细胞后细胞增殖的变化，通过细胞生长曲线观察转染前后细胞生物学行为的变化。4．以流式细胞仪检测重组质粒A，B，C，D转染A549细胞后细胞周期及凋亡的变化。结果1．利用PCR分析，DNA测序证实HnRNP B1特异性的siRNA表达载体A，B，C，D已成功构建。2．重组质粒A，B，C，D及空质粒E通过脂质体Lipofectamine 2000瞬时转染A549细胞24小时，采用RT-PCR检测HnRNP B1 mRNA的表达，结果显示：未转染组F、空质粒组E HnRNP B1 mRNA的表达与转染前比较均无明显变化，而A，B，C，D组HnRNP B1 mRNA的表达明显下调，分别下降了46％、65％、58％、73％（p＜0.05）。3．重组质粒A，B，C，D稳定转染A549细胞，抗性克隆形成后1周，它们对HnRNP B1 mRNA抑制率分别为77.69％、74.37％、75.65％、83.04％，HnRNP B1蛋白的表达有不同程度的降低，而空质粒E在转染前后无明显变化。4．重组质粒A，D稳定转染A549细胞抗性克隆形成后4周，对HnRNP B1 mRNA抑制率分别为65.8％、70.3％，HnRNP B1蛋白的表达仍有明显降低，而空质粒E在转染前后仍无明显变化。5．重组质粒A，D转染A549细胞抗性克隆形成后6周，对HnRNP B1 mRNA抑制率分别为41.06％、49.88％，HnRNPB1蛋白的表达与空质粒E转染A549细胞后HnRNPB1蛋白的表达与转染前无明显变化。6．重组质粒A，D转染A549细胞后，与未转染F组及空质粒E组比较，细胞增殖明显减慢（P＜0.05）。而空质粒E组细胞与未转染F组相比，细胞增殖无明显变化（P＞0.05）。7．重组质粒A，B，C，D转染A549细胞抗性克隆形成后1周，与未转染组相比，G1期细胞比例明显增多，S期细胞比例明显降低；FCM检测示细胞发生了明显的凋亡，凋亡率分别为：17.84±0.45％、19.44±1.35％、16.6±2.91％、28.5±1.59％。重组质粒A，D转染A549细胞抗性克隆形成后4周、6周G1期细胞比例逐渐减少，S期细胞比例逐渐增多，细胞的凋亡率分别为：11.2±1.43％、15.9±2.13％；6.7±1.03％、4.9±0.73％，随着时间的延长，凋亡的效果降低。重组质粒对A549细胞HnRNP B1基因的抑制作用可以维持4周以上。结论（1）HnRNP B1 siRNA表达载体能特异、高效地抑制肺癌细胞A549 HnRNP B1基因的表达，作用时间至少可维持抗性克隆形成后4周；（2）可抑制肺癌细胞的增殖，促进肺癌细胞的凋亡，有望成为肺癌基因治疗的合理策略之一。