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目的先前的研究表明肺癌细胞株及肺癌组织中HnRNP B1的表达明显增高,并可能是肺癌的早期分子标志。然而HnRNP B1在肺癌发病中的分子机制尚未完全明了。本研究构建HnRNPB1特异性的siRNA真核细胞表达载体并转染人肺癌细胞株A549,了解重组载体对A549细胞HnRNPB1基因的干扰效果以及对肺癌细胞生长增殖、细胞周期及凋亡的影响,进一步探讨HnRNPB1基因在肺癌发生发展中的作用,并为RNA干扰(RNAi)分子靶向基因治疗肺癌提供一种新的手段和理论基础。方法1.利用计算机辅助设计软件,根据GenBank数据库提供的HnRNP B1基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,在HnRNPB1序列中选取AAAACTTTAGAAACTGTTCCT(7一27)、AACAGTTCCGTAAGCTCTTTA(52一72)、AAGCTGTTTGTTGGCGGAATT(336一356)、AAAGGCTTTGTCTAGACAAGA(554一574)4段作为靶序列,设计4对双链小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(Small hairpin RNAs,shRNA)的4对DNA序列,并与psiRNA质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子Hl的真核表达载体,得到HnRNP B1特异性siRNA的4对重组质粒,分别命名为A,B,C,D,经PCR和DNA测序进行鉴定。2.采用脂质体Lipofectamine 2000瞬时转染A549细胞24小时,RT-PCR检测HnRNP B1 mRNA的表达。在瞬时转染的基础上,利用该载体带有的药物抗性筛选系统进行稳定转染,筛选出阳性A549细胞克隆,以荧光定量RT-PCR检测不同时间点转染前后HnRNP B1 mRNA表达的变化、western blot检测转染前后HnRNP B1蛋白表达的变化。3.采用MTT法检测重组质粒A,B,C,D转染A549细胞后细胞增殖的变化,通过细胞生长曲线观察转染前后细胞生物学行为的变化。4.以流式细胞仪检测重组质粒A,B,C,D转染A549细胞后细胞周期及凋亡的变化。结果1.利用PCR分析,DNA测序证实HnRNP B1特异性的siRNA表达载体A,B,C,D已成功构建。2.重组质粒A,B,C,D及空质粒E通过脂质体Lipofectamine 2000瞬时转染A549细胞24小时,采用RT-PCR检测HnRNP B1 mRNA的表达,结果显示:未转染组F、空质粒组E HnRNP B1 mRNA的表达与转染前比较均无明显变化,而A,B,C,D组HnRNP B1 mRNA的表达明显下调,分别下降了46%、65%、58%、73%(p<0.05)。3.重组质粒A,B,C,D稳定转染A549细胞,抗性克隆形成后1周,它们对HnRNP B1 mRNA抑制率分别为77.69%、74.37%、75.65%、83.04%,HnRNP B1蛋白的表达有不同程度的降低,而空质粒E在转染前后无明显变化。4.重组质粒A,D稳定转染A549细胞抗性克隆形成后4周,对HnRNP B1 mRNA抑制率分别为65.8%、70.3%,HnRNP B1蛋白的表达仍有明显降低,而空质粒E在转染前后仍无明显变化。5.重组质粒A,D转染A549细胞抗性克隆形成后6周,对HnRNP B1 mRNA抑制率分别为41.06%、49.88%,HnRNPB1蛋白的表达与空质粒E转染A549细胞后HnRNPB1蛋白的表达与转染前无明显变化。6.重组质粒A,D转染A549细胞后,与未转染F组及空质粒E组比较,细胞增殖明显减慢(P<0.05)。而空质粒E组细胞与未转染F组相比,细胞增殖无明显变化(P>0.05)。7.重组质粒A,B,C,D转染A549细胞抗性克隆形成后1周,与未转染组相比,G1期细胞比例明显增多,S期细胞比例明显降低;FCM检测示细胞发生了明显的凋亡,凋亡率分别为:17.84±0.45%、19.44±1.35%、16.6±2.91%、28.5±1.59%。重组质粒A,D转染A549细胞抗性克隆形成后4周、6周G1期细胞比例逐渐减少,S期细胞比例逐渐增多,细胞的凋亡率分别为:11.2±1.43%、15.9±2.13%;6.7±1.03%、4.9±0.73%,随着时间的延长,凋亡的效果降低。重组质粒对A549细胞HnRNP B1基因的抑制作用可以维持4周以上。结论(1)HnRNP B1 siRNA表达载体能特异、高效地抑制肺癌细胞A549 HnRNP B1基因的表达,作用时间至少可维持抗性克隆形成后4周;(2)可抑制肺癌细胞的增殖,促进肺癌细胞的凋亡,有望成为肺癌基因治疗的合理策略之一。