荧光分子层析成像(Fluorescence molecular tomography,FMT)结合了特异性荧光分子标记技术及扩散光学层析成像(Diffuse Optical Tomography,DOT)技术具备的优势,有望实现活体组织内部与细胞或者分子相关的生化反应过程的在体检测。然而在小动物在体成像研究中,由于受到解剖结构获取困难、有效背景光学参数缺失以及重建过程存在的高度不适定性的影响,现有FMT技术的空间分辨率、定量性以及鲁棒性尚待提高。面向小动物在体X射线层析(X-ray Computed Tomography,XCT)/DOT/FMT多模态成像应用,本文研究了目标鼠的解剖学结构以及光学结构先验信息在体获取方法以及能够有效克服重建不适定性的FMT方法。本文发展了基于XCT图像非刚体配准的目标鼠解剖结构在体获取方法。首先通过基于特征点匹配的初配准过程以及基于特征块匹配的后配准过程,将标准数字鼠的XCT图像配准至目标鼠XCT图像;接着利用配准位移场,对标准数字鼠解剖结构图谱施加非刚体几何形变,构建目标鼠全身解剖结构图谱。数值模拟与小鼠实验证明提出的算法能够有效地进行图像配准并完成目标鼠解剖结构图谱的构建。本文提出了配准解剖结构图谱导引的时域DOT重建方法,用于在体获取目标鼠光学结构信息。首先对目标鼠进行XCT与时域DOT实验,获取双模态测量数据;接着利用图像配准策略获取目标鼠的解剖结构信息;最后以硬先验正则化方法约束基于广义脉冲谱特征数据的时域DOT重建过程,在体获取目标鼠各区域光学参数;结合解剖结构,构建目标鼠光学结构。数值模拟证明所提出方法有效,通过多组小鼠实验进一步获得了不同目标鼠主要器官的在体光学参数。本文发展了基于微扰蒙特卡洛模拟的时间分辨早期到达光FMT成像方法,用于改善重建过程存在的不适定性。通过系统响应函数校正的微扰蒙特卡洛模拟进行准确的光子输运建模以及进行荧光Jacobian矩阵的计算;利用重叠时间门技术处理时间飞行曲线,用于增加噪声鲁棒性;选择早期到达光对应的时间门进行重建,用于降低FMT的病态性。仿体实验证明,相较于传统的早期到达光FMT方法,本文提出的方法能够有效提升图像的分辨率与定量性。为了解决现有FMT存在的诸多问题,本文提出了基于XCT图像配准的解剖结构获取方法、配准解剖结构导引的时域DOT光学参数重建方法以及基于微扰MC模拟的时间分辨早期到达光FMT重建方法。论文首先针对所提出的各方法进行了数值模拟验证,接着搭建了仿CT扫描的时域DOT/FMT系统,并通过多组仿体或小鼠在体实验证明了相关算法的有效性。