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背景:丘脑室旁核(paraventricular thalamic nucleus,PVT)属于丘脑中线核群,其功能越来越受到人们的关注。目前,研究报道PVT与诸多情绪活动如恐惧、焦虑、摄食行为等有关。其中,PVT参与小鼠的恐惧学习记忆已被证实。近期有文章报道通过药理遗传学方法抑制PVT内神经元活性能够激活疼痛下行抑制系统,从而缓解急性胰腺炎所导致的内脏痛,但具体作用机制不清。PVT与杏仁中央核(central amygdaloid nucleus,CeA)之间有密切的纤维联系。Ce A可被伤害性刺激所激活,被称为“伤害性杏仁核”,同时参与疼痛及相关负性情绪的感知和调节。此外,Ce A内几乎所有的神经元均为γ-氨基丁酸(GABA)能抑制性神经元。但目前Ce A参与慢性痛调节的上下游通路及其相关作用机制,尚未完全阐明。CeA作为疼痛与情绪活动的交汇点,不但广泛接受PVT的纤维投射,同时也能向中脑导水管周围灰质腹外侧区(ventrolateral subregion of periaqueductal gray,vl PAG)发出投射。vl PAG属于内源性疼痛调控系统中的一个关键性核团,可激活内源性中枢镇痛系统。而目前的观点认为:内源性调控系统的失衡及其可塑性改变是疼痛持续慢性化的关键。以往的研究报道多集中在PAG-延髓吻端腹内侧区(rostral ventromedial medulla,RVM)-脊髓背角(dorsal horn of spinal cord,SDH)这条下行通路上,对于PAG接受哪些上位结构信息的调控,形成怎样的调控通路以及调控机制如何,鲜见报道。根据我们前期的实验结果,本课题组将目光聚焦于丘脑室旁核-杏仁中央核-中脑导水管周围灰质腹外侧区(PVT-Ce A-vl PAG)通路,并提出如下假设:即存在一条PVT-Ce A-vl PAG疼痛下行调节通路,通过调控内源性疼痛下行抑制系统,发挥易化疼痛的作用。为了验证该通路的存在及其作用,我们设计一系列的实验对其进行研究,包括对该通路上下游核团的束路追踪、参与神经病理性痛的调控机制及其相关神经活性物质。目的:证实PVT-Ce A-vl PAG通路并研究其在疼痛慢性化过程中发挥的作用,并进一步分析参与神经病理性痛过程的神经活性物质,为研究中枢内源性疼痛调控系统及疼痛慢性化的作用机制提供理论依据,为阐明的机制提供新思路,最终为开发有效的疼痛药物治疗提供有针对性的干预靶点。材料和方法:首先采用顺行和逆行束路追踪技术、免疫组织化学染色和包埋前免疫电镜技术证实PVT-Ce A-vl PAG通路存在;其次运用束路追踪和免疫组织化学多重染色技术观察神经病理性痛状态下PVT和Ce A内神经元的激活情况(FOS表达及其相关神经元类型);进而运用化学损毁和药理遗传学方法观察抑制PVT神经元活性对神经病理性痛动物痛行为的影响;利用光遗传学方法观察激活PVT-Ce A通路对正常动物痛行为的影响;最后运用原位分子杂交和免疫组化双标染色技术探讨PVT-Ce A-vl PAG通路参与疼痛下行调控的神经活性物质。结果:1.Ce A逆行(荧光金,FG)和顺行(生物素葡聚糖胺,BDA)束路追踪观察到PVT与Ce A以及Ce A与PAG之间有大量纤维联系;神经病理性痛刺激可致PVT、Ce A和PAG内的部分神经元表达FOS蛋白,证实这些神经元在神经病理性痛状态下被激活。2.运用束路追踪技术将顺行追踪剂BDA注入PVT,同时将逆行示踪剂FG注入vl PAG,免疫荧光双标结果显示Ce A内存在大量FG逆标神经元及BDA顺标轴突终末,且两者之间存在密切接触;包埋前免疫电镜结果显示Ce A内BDA阳性终末(DAB反应产物阳性,突触前终末)与FG阳性树突(纳米金标记,突触后结构)之间形成非对称性突触。3.由PVT-Ce A投射神经元在神经病理性痛状态下被激活(FOS阳性);进一步将BDA注入PVT,同时将FG注入vl PAG,免疫荧光三标结果可见Ce A内FG与FOS双标阳性神经元,且部分双标神经元同时与BDA标记终末形成密切接触。4.通过化学损毁和DREADDs技术特异性抑制PVT内神经元活性观察到神经病理性痛大鼠的机械性痛刺激反应的阈值明显提高(P<0.01);运用光遗传学特异性兴奋PVT-Ce A通路观察到正常动物的机械性缩足阈值明显降低,出现机械性痛敏现象(P<0.05)。5.将逆行追踪剂FG注射到PVT,外侧臂旁核(LPB)内观察到FG逆标神经元,即LPB内存在LPB-PVT投射神经元;进一步运用荧光素逆行双标方法分别将逆行示踪剂FG和四甲基罗达明TMR分别定位注射入PVT和Ce A内,免疫荧光双标结果显示LPB内存在FG和TMR逆标神经元双标现象,即LPB内部分神经元同时向PVT和Ce A发出分支投射;此外这些分支投射的神经元能够被神经病理性痛信息刺激激活且为CGRP阳性,为深入研究PVT和Ce A参与神经病理性痛的机理调控提供形态学资料。6.利用原位分子杂交技术观察到PVT内含有大量VGLUT2 m RNA阳性神经元,但未见VGLUT1 m RNA阳性神经元;进一步将TMR注入Ce A,原位分子杂交和免疫荧光双标结果显示在PVT内TMR逆标神经元均呈VGLUT2 m RNA阳性;将BDA注入PVT,同时将FG注入vl PAG,免疫荧光三标结果可见Ce A内BDA样轴突终末与FG逆标神经元的胞体形成密切接触,且部分BDA样阳性终末与VGLUT2样阳性终末存在双标,提示在PVT-Ce A-vl PAG投射通路上,由PVT向Ce A投射的神经元为VGLUT2样阳性的兴奋性神经元。7.将BDA注入Ce A,免疫荧光双标观察到vl PAG内有大量5-HT阳性神经元及BDA顺行标记轴突终末。可见局部BDA样阳性终末与5-HT神经元的胞体或树突之间形成密切接触。结论:1.从神经束路追踪、免疫荧光双重标记等形态学角度证实了PVT-Ce A-vl PAG通路的存在,且在电镜下观察到由PVT向Ce A投射的轴突终末与Ce A内的Ce A-vl PAG投射神经元之间形成非对称性的兴奋性突触。2.PVT、Ce A和PAG三个核团内的部分神经元均在神经病理性痛状态下被激活,表达FOS蛋白,证明三个核团参与了神经病理性痛的调控过程。进一步综合运用神经束路追踪和免疫组织化学染色技术证实了神经病理性痛信息刺激激活PVT-Ce A投射神经元。3.通过化学损毁或DREADDS技术特异性抑制PVT神经元活性能缓解神经病理性痛所引起的机械性痛敏;反之,利用光遗传学技术特异性兴奋PVT-Ce A投射神经元能诱发正常动物出现机械性痛敏。以上结果直接证实PVT-Ce A通路在神经病理性痛过程中发挥下行易化疼痛的作用。4.在LPB内可观察到同时向PVT和Ce A发出分支投射的神经元,且部分神经元表达CGRP样免疫阳性;进一步观察到神经病理性痛刺激激活LPB内部分向PVT和Ce A分支投射的神经元表达FOS蛋白,提示这些激活状态的神经元参与了神经病理性痛的调控过程。5.免疫荧光多重标记和原位分子杂交技术证实PVT-Ce A投射神经元主要为VGLUT2阳性神经元;而Ce A投射终末则主要作用于vl PAG内的5-HT神经元。以往研究报道Ce A内所有的神经元几乎均为GABA能抑制性神经元,结合本论文中的结果,我们最终证实:PVT内谷氨酸能兴奋性神经元(VGLUT2阳性)能够向Ce A发出投射,作用于该核团内的GABA能抑制性神经元上;而后者则下行作用于vl PAG内的5-HT神经元,由此一来就存在一条PVT-Ce A-vl PAG下行投射通路,通过抑制vl PAG内属于下行抑制系统的5-HT阳性神经元,最终发挥对疼痛的下行易化作用。该通路在神经病理性痛时处于激活状态,而抑制该通路能够显著改善神经病理性痛大鼠的机械性痛敏。该通路的研究为阐明疼痛慢性化的中枢机制提供了理论基础。