金花葵(Hibiscus manihot L.),为锦葵科(Malvaceae)秋葵属(Abelmoschus)一年生草本植物,是20世纪80年代末农业资源普查时的濒于灭绝的珍稀植物。金花葵具有清利湿热、消炎镇痛等功效,内服主治五淋、水肿,外用治疗汤水烫伤等。本文以抗炎活性为指导,确定了金花葵的花提取物抗炎效果最佳,继而对金花葵花化学成分进行系统分离、纯化与结构鉴定;利用现代分析方法建立了高效、快速的金花葵花活性成分质量控制分析方法;考察了中国东北地区不同采收时间金花葵花中活性成分含量及其抗氧化、抗炎活性变化的研究,确定了金花葵花的最佳采收时间;优化了新型绿色提取溶剂-茶皂素溶液结合负压空化提取的工艺条件;结合大孔吸附树脂及高速逆流色谱技术对提取液中的目标成分进行富集分离纯化,本论文研究为金花葵资源的全面开发利用提供了科学依据与应用技术基础。全文工作取得进展如下:1.利用硅胶柱色谱、Sephdex LH-20凝胶柱色谱、ODS-C18柱色谱、高速逆流色谱等分离方法,从金花葵花提取物的抗炎有效部位中分离得到了 19个单体成分,并根据理化性质和光谱数据(IR、MS、1H-NMR、13C-NMR等)鉴定了其中的17个单体成分:β-谷甾醇(1)、胡萝卜苷(2)、十六烷酸(3)、十七烷酸乙酯(4)、亚油酸甲酯(5)、二十六烷酸(6)、槲皮素(8)、槲皮素-3’-O-β-D-葡萄糖苷(9)、杨梅素(10)、棉皮素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(11)、金丝桃苷(12)、异槲皮苷(13)、芦丁(14)、绿原酸(16)、新绿原酸(17)、咖啡酸(18)、槲皮素-3-O-洋槐糖苷(19)。其中,化合物1、2、4、5、8、9、11、14、16、17、18、19等12个化合物均为首次从该植物中分离得到。另外2个单体化合物7和15的结构正在鉴定中。2.建立了同时分析检测金花葵花中主要活性成分的RP-HPLC质量控制分析方法,具体如下:色谱柱:HIQ sil C18W column(250 mm × 4.6 mm i.d.,5 μm);流动相:0.5%磷酸水溶液(A)和乙腈(B);梯度洗脱条件:0-40 min,90-83%(A);40-59 min,83-67%(A);59-62 min,67-90%(A);检测波长:绿原酸、新绿原酸和咖啡酸为330 nm,其他7种成分为254 nm;流速:1mL/min;柱温:30℃;进样量:5μL。在上述条件下,首次实现了金花葵中10种有机酸及黄酮类活性成分的分离、定性定量分析,本方法灵敏度高、精密度高、重复性好,适合用于金花葵中活性成分的质量控制分析,为金花葵资源的研究开发与高效利用提供了必要依据与检测手段。3.考察了东北地区不同采收时间金花葵花活性成分含量及其抗氧化、抗炎活性的变化规律测定了花期内不同采收时间金花葵花中的活性成分的动态变化规律及抗氧化、抗炎活性变化,8月初的金花葵样品总酚、总黄酮含量较高,同时具有较好的DPPH自由基清除活性、ABTS自由基清除活性、还原力与FRAP活性,并且在ABTS自由基清除活性、还原力与FRAP活性中,8月初样品的活性要明显高于阳性对照。HPLC分析结果表明金花葵花中金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷和槲皮素-3’-0-葡萄糖苷是主要的活性成分,且在8月初的样品中这四种活性成分含量较高。主成分分析法对花期内不同采收时间的样品进行了品质评价,结果发现8月初的样品具有较高的活性成分及生物活性,为金花葵花品质最佳的时间区段。4.优化了表面活性剂负压空化辅助提取金花葵花中活性成分的提取工艺考察了表面活性剂的种类、浓度,负压压力,乙醇浓度,液固比,提取时间,提取温度对芦丁(RU)、金丝桃苷(HY)、异槲皮苷(ISQ)、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷(HI)、杨梅素(MY)、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷(QOG)和槲皮素(QU)提取率的影响,确定最佳提取工艺参数:表面活性剂浓度:0.5 w/v%茶皂素(TS)乙醇浓度:60%液固比:53:1 mL/g提取时间:16 min提取温度:61℃在上述最佳提取工艺条件下,对芦丁(RU)、金丝桃苷(HY)、异槲皮苷(ISQ)、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷(HI)、杨梅素(MY)、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷(QOG)和槲皮素(QU)提取率的平均值分别为 0.297 mg/g、6.188 mg/g、4.847 mg/g、7.334 mg/g、0.174 mg/g、0.627 mg/g、0.336 mg/g,提取结果表明,表面活性剂负压空化辅助提取(S-NPCE)是一种绿色高效、能耗低、提取率高的提取技术,同时选用的表面活性剂具有绿色环保、价格低廉等优点,有巨大的应用潜力,适用于对植物材料中天然活性化合物成分的高效提取。此外,采用分子对接预测与傅里叶红外验证实验同时证明茶皂素溶液,可以作为一种提取溶剂,通过目标分子与茶皂素间形成分子间氢键,协同负压空化提取法或其他提取方法提取金花葵花中的槲皮素及其他目标黄酮类化合物,本实验结果也为合理开发与综合利用金花葵资源提供了重要的科学依据。5.确定了大孔吸附树脂结合高速逆流色谱技术分离纯化金花葵花中化学成分的工艺条件参数:(1)确定了大孔吸附树脂富集分离的工艺条件:树脂型号:AB-8型上样体积:3 BV解吸溶液及体积:3 BV40%乙醇和8 BV 70%乙醇在上述优化的条件下,金花葵花中七种目标成分在富集产物中含量分别达到0.28%、5.45%、4.17%、6.70%、0.15%、0.59%和 0.32%,回收率分别为 84.23%、79.57%、77.84%、82.3%、78.19%、85.41%和 87.03%。(2)确定了高速逆流色谱分离纯化AB-8树脂富集产物的工艺条件:溶剂系统:乙酸乙酯-甲醇-水(100:3:100,v/v/v)洗脱流速:2 mL/min洗脱转速:900 rpm/min检测波长:254 nm在上述优化条件下,通过一次大孔吸附树脂的富集,结合高速逆流色谱的分离纯化和重结晶后,分别得到绿原酸、咖啡酸、槲皮素-3-O-洋槐糖苷、芦丁及棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷,其纯度均在95%以上,回收率分别为94.37%、96.58%、95.21%、97.69%和 96.44%。溶剂系统:正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:5:1:5,v/v/v/v)洗脱流速:2 mL/min洗脱转速:850 rpm/min检测波长:254nm在上述优化条件下,通过一次大孔吸附树脂的富集,结合高速逆流色谱的分离纯化和重结晶后,分别得到金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷及槲皮素-3’-O-葡萄糖苷,其纯度均在95%以上,回收率分别为93.91%、98.02%、95.78%和94.81。该工艺具有溶剂可重复利用、产品纯度高、易于规模化放大的特点。与以传统分离介质硅胶为固定相的色谱相比,高速逆流色谱更适用于金花葵花中天然产物化学成分的快速分离纯化。此外,采用HPLC、ESI-MS/MS等技术验证了分离纯化单体的化学结构。6.完成了金花葵花中化学成分的提取富集工艺的放大化验证实验放大化验证实验中金花葵花中目标成分的提取率分别为0.267、5.445、4.411、6.161、0.160、0.545和0.294 mg/g,与实验室小试规模的提取结果相当,表明所使用的负压空化混悬固液萃取分离装置对金花葵花中的目标成分可以达到较好的提取效果;放大化富集实验中七种目标成分在富集产物中的含量分别为0.25%、5.13%、3.85%、6.29%、0.13%、0.51%和 0.27%,回收率分别为 83.98%、80.07%、78.21%、81.49%、77.68%、86.27%和87.45%,含量与回收率与实验室小试结果相一致,表明建立的金花葵花中化学成分的提取富集工艺稳定且可靠,为工业化规模放大生产提供了数据支撑,也为实现资源的高效利用与开发提供了科学依据。