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1目的20(R)-人参皂苷Rg3是扶正中药人参的主要活性成分之一,它具有抑制肿瘤新生血管形成、防止肿瘤复发、扩散和转移的作用,临床疗效已被中国中医科学院广安门医院在内的多个肿瘤研究中心所证实。然而,20(R)-人参皂苷Rg3制剂方法落后、生物利用度低的缺点,在一定程度上限制了其疗效和临床应用。采用聚乙二醇(PEG)／聚乳酸羟基乙酸(PLGA)制备的纳米药物载体包埋Rg3,使其能够缓释对提高其疗效有着积极意义,并能为设计、研制和开发新型、高效的抗肿瘤中药提供新的思路。本研究通过体内和体外实验,比较Rg3原药和PEG-PLGA-人参皂苷Rg3纳米缓释微粒对肺癌血管新生多个相关指标的作用,验证人参皂苷Rg3纳米化制备的可行性和优越性。2方法2.1体外实验部分采用MTT法检测Rg3和Rg3纳米缓释微粒对EA.hy926内皮细胞和PG肺癌细胞增殖的作用,观察其是否具有差异化细胞毒作用。采用流式细胞术碘化丙啶(PI)单染法检测Rg3和Rg3纳米缓释微粒对EA.hy926内皮细胞细胞周期分布的影响,并比较二者作用的差异。采用流式细胞术Annexin V-FITC/PI双标记法检测Rg3和Rg3纳米缓释微粒对EA.hy926内皮细胞凋亡的影响,并比较二者作用的差异通过细胞侵袭实验和微管形成实验观察Rg3和Rg3纳米缓释微粒对EA.hy926内皮细胞侵袭能力和微管形成能力的影响,来观察Rg3和Rg3纳米缓释微粒是否能在不致内皮细胞死亡的情况下影响内皮细胞的功能及二者作用的差异。用Rg3和Rg3纳米缓释微粒干预EA.hy926细胞,采用实时定量PCR法检测VEGF mRNA表达、Western blot法检测E-cad.MMP-9、HIF-1a.VEGF的蛋白表达来探索它们作用的内在分子机制。2.2体内实验部分建立小鼠Lewis肺癌动物模型,60只小鼠随机分为5组：人参皂苷Rg3纳米微粒组(Rg3-N)、PEG-PLGA纳米载体组(PEG)、20(R)-人参皂苷Rg3组(Rg3)、生理盐水组(NS)和空白对照组(C),每组12只,灌胃给药共14天。每隔2d测量小鼠的体重并绘制小鼠体重变化曲线,观察各组毛色、活动和精神状态等一般情况。于实验结束当天,处死小鼠,剥离瘤组织并称重,计算抑瘤率和肿瘤体重比；免疫组化法CD31抗体标记血管内皮细胞来计算微血管密度(MVD),评价Rg3和Rg3纳米缓释微粒的体内抗血管生成作用。采用实时定量PCR法检测VEGF mRNA表达,免疫组化法和Western blot法检测TSP-1、E-cad、Ki-67、MMP-9、HIF-1α、VEGF蛋白表达来探讨Rg3和Rg3纳米缓释微粒体内抗血管生成作用的内在分子机制。3结果3.1体外实验部分0.004ug/ml、0.04ug/ml、0.4ug/ml、4ug/ml、40ug/ml的Rg3和Rg3纳米微粒处理EA.hy926内皮细胞和PG肺癌细胞24h和48h后,各实验组的OD值与对照组相比均没有显著性差异(P>0.05),未见量效关系的存在,Rg3和Rg3纳米微粒之间亦未见显著性差异(P>0.05)。0.4、4、40ug/ml的Rg3和Rg3纳米微粒处理48h后,EA.hy926细胞的细胞周期分布与对照组相比无显著性差异(P>0.05),相同剂量的Rg3和Rg3纳米微粒之间以及Rg3和Rg3纳米微粒不同剂量之间亦未见显著性差异(P>0.05)。0.4、4、40ug/ml的Rg3和Rg3纳米微粒处理48h后,EA.hy926细胞的凋亡与对照组相比无显著性差异(P>0.05),相同剂量的Rg3和Rg3纳米微粒之间以及Rg3和Rg3纳米微粒不同剂量之间亦未见显著性差异(P>0.05)。1.6、8、40ug/ml的Rg3和Rg3纳米微粒处理48h后,EA.hy926细胞的侵袭能力与对照组相比显著下降(P<0.05),且呈剂量依赖性；但Rg3纳米微粒处理组与相应浓度的Rg3处理组之间,差异并不显著(P>0.05)。1.6、8、40ug/ml的Rg3和Rg3纳米微粒处理48h后,1.6ug/ml的Rg3和Rg3纳米微粒不能显著影响EA.hy926细胞形成微管结构的数目(P>0.05),8ug/ml、40ug/ml的Rg3和Rg3纳米微粒可使EA.hy926细胞形成微管样结构的能力显著下降(P<0.05),但两个剂量之间无显著性差异(P>0.05),相同浓度的Rg3和Rg3纳米微粒之间也无显著性差异(P>0.05)与对照组相比,40ug/ml的Rg3和Rg3纳米微粒处理48h不能显著影响VEGF的蛋白表达以及VEGF的基因表达,但可降低MMP-9和E-cad的表达,Rg3和Rg3纳米微粒之间未见明显差异,各组均未检测到HIF-1α蛋白的表达。3.2体内实验部分NS组和PEG组小鼠的体重呈现先升后降的趋势,而其余三组小鼠的体重则呈现逐渐上升并保持稳定的趋势。相对于NS组,Rg3组和Rg3-N组小鼠的毛色更亮,精神状态更好,更加活跃,一般状况较好。PEG组、Rg3组和Rg3-N组的瘤重与NS组相比无显著性差异(P>0.05),但Rg3组和Rg3-N组的肿瘤体重比和MVD明显下降,与NS组之间有显著性差异(P<0.01),但Rg3组和Rg3-N组之间未见显著性差异(P>0.05)。与NS组相比,Rg3组和Rg3-N组的VEGF mRNA和MMP-9、HIF-1α、VEGF的蛋白表达水平显著下降,且Rg3-N组低于Rg3组；Rg3-N组的E-cad蛋白表达与NS组和Rg3组相比具有显著性差异(P<0.01)。Rg3组和Rg3-N组的TSP-1和Ki-67表达与NS组相比无显著性差异(P>0.05),Rg3组和Rg3-N组之间未见显著性差异(P>0.05)。4结论(1)Rg3和Rg3纳米缓释微粒不具有直接的细胞毒作用,不能影响内皮细胞的凋亡、细胞周期和增殖,也不具有在体内直接抑制肿瘤细胞增殖的能力；(2)Rg3和Rg3纳米缓释微粒可在体外抑制内皮细胞的侵袭能力和微管形成能力,这些作用可能是通过抑制E-Cad和MMP-9的表达来实现的；(3)Rg3和Rg3纳米缓释微粒具有体内抗血管生成作用,这种作用可能与抑制MMP-9、HIF-1α、VEGF的表达有关；(4)Rg3和Rg3纳米缓释微粒可改善动物的一般状态(5)体内实验中Rg3-N组在某些指标上效果优于Rg3组,可能是由于PEG-PLGA纳米载体包埋赋予的缓释性使Rg3能在体内维持更长时间的血药浓度所致