肿瘤坏死因子（TNF-a）是一种主要由活化的单核/巨噬细胞产生的多效性细胞因子，可介导不同靶细胞增殖、分化、坏死及凋亡，具有广泛的免疫调节作用和病理生理作用，它在体内以跨膜型（Transmembrane TNF-a，mTNF-a）和分泌型（secreted TNF-a，sTNF-a）两种形式发挥作用。近来研究报道，在慢性炎症的局部和肿瘤组织中聚集有大量的未成熟髓样抑制细胞（myeloid derived suppressor cell，MDSC），包括未成熟的巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞等，具有很强的免疫抑制作用，是引起肿瘤免疫逃逸的重要细胞群体[5-8]。有研究发现：MDSC浸润肿瘤组织后可分化为肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和血管内皮细胞[9]，这两类细胞又是肿瘤组织中主要的基质细胞，能分泌大量TNF-a，TAM表达的跨膜型TNF-a能通过细胞间直接接触而介导活化的CD8+T细胞凋亡，这些数据提示MDSC的聚集及其免疫抑制功能很与TNF-a有关。为研究跨膜型和分泌型TNF-a对髓样抑制细胞功能的影响及其机制，本课题构建了鼠sTNF-pTriex4hisC重组质粒并高效表达了鼠sTNF-a重组蛋白，为后续的科研工作创造了条件。本研究主要内容如下：　　 ㈠WT-TNF-pcDNA3.1C重组质粒的构建及鉴定。　　 ⑴提取小鼠腹腔巨噬细胞的总RNA，采用RT-PCR扩增出野生型TNF-a （WT-TNF）的cDNA片断；同时，抽提质粒pcDNA3.1C，将二者分别用BamHI和EcoR I双酶切后，经回收、连接、转化大肠杆菌DH5a，挑选阳性克隆。　　 ⑵阳性克隆的鉴定：以菌落PCR初步筛选阳性克隆，再用上述限制性内切酶双酶切鉴定，结果显示重组体经酶切后，得到约708bp左右的目的片断，与连接的目的基因大小一致。进一步经DNA测序分析鉴定，证明成功构建了插入有WT-TNF全长序列的重组质粒鼠WT-TNF-pcDNA3.1C。　　 ㈡sTNF-pTriex4hisC重组质粒的构建及鉴定。　　 ⑴重组体的构建和克隆：以WT-TNF-pcDNA3.1C质粒为模板，采用重叠PCR方法删除WT-TNF中的信号肽序列，从而得到仅仅只含有分泌型TNF-a的DNA序列片段，再用BamHI和EcoR I将该目的基因和 pTriex4hisC载体（此载体中含组氨酸his标签，有利于后续的蛋白纯化）进行双酶切，然后，经回收、连接、转化大肠杆菌DH5a，挑选阳性克隆。　　 ⑵阳性克隆的鉴定：以菌落PCR初步筛选阳性克隆，再用上述限制性内切酶双酶切进行鉴定，结果显示重组体经酶切后，得到约471bp左右的目的片断，与连接的目的基因大小一致。进一步经DNA测序分析鉴定，证明成功构建鼠sTNF-pTriex4hisC重组质粒。　　 ㈢鼠sTNF-a融合蛋白的诱导表达及鉴定。　　 将sTNF-a-pTriex4hisC重组质粒转染大肠杆菌BL-21，经IPTG诱导，获得鼠融合蛋白sTNF-a；用Ni2+－NTA介质分离纯化sTNF-a蛋白后，经SDS－PAGE凝胶电泳及western blot鉴定显示，上述纯化的蛋白确为小鼠sTNF-a蛋白，且纯度较高。