骨质疏松的定义为骨量降低和骨结构恶化，这些可以导致骨组织脆性增加及病理性骨折增多。在骨的微环境中成骨细胞带来的骨形成及破骨细胞带来的骨吸收式骨质疏松形成的病理过程，该过程涉及到多种内源性（如基因和激素）和外源性（如营养和功能锻炼）因素来共同调节骨组织的重构。尽管骨质疏松的危险因素可以通过生活状态（饮食和合理的功能锻炼），药物（钙剂，维生素D，激素替代药物）治疗来防范，但是，骨质疏松骨折带来的残疾和死亡仍然严重的影响老年人口尤其是65岁以上老年人生命质量的。目前老龄骨质疏松症的分子调控机制尚不完全清楚，因此我们的研究排除了性激素及糖皮质激素的影响而主要关注着男性老龄骨质疏松症的病理机制和过程。之前的研究显示在骨重建过程中骨形成的缺陷使老龄骨质疏松症的主要病理机制。骨髓中的骨髓基质干细胞（Bone marrow mesenchymal cells，BMSCs)是成人骨重建中成骨前体细胞的主要来源，因此了解调控老龄骨质疏松患者BMSCs成骨分化的调控机制并强化其成骨分化能力是进一步探索骨质疏松症诊断和治疗的关键。整合素α和β跨膜结构可以触发及调节细胞的粘附及分化过程，其是细胞同周围大分子基质环境相互作用的重要调节因子。之前的研究显示整合素αV，α5β1，αvβ3和β3/β5参与了成骨细胞同周围大分子基质环境相互作用从而影响了成骨细胞的功能及骨重建的过程。在成骨分化过程中如果使用整合素α5或β1抗体干预可以使成骨细胞的矿化减少大约20%和45%，相应的αVβ3抗体干预可以减少大概65%，α2β1抗体干预可以减少近95%。此外，在人BMSCs成骨分化中整合素α2β1，α5β1及αVβ3可以活化细胞内信号通道及随后的碱性磷酸酶和骨钙素表达。整合素在老龄骨质疏松中的分布特点及调控机制尚未明确，因此我们研究了老龄骨质疏松症患者BMSCs上整合素的表达特点和作用。【目的】1、老龄骨疏患者BMSCs的分离、培养、鉴定及成骨能力检测；2、老龄骨质疏松患者BMSCs整合素表达特点的研究；3、构建和包装带有Integrinα2慢病毒载体，包装成慢病毒后转染上述BMSCs；4、观察转染后生物学功能、成骨能力及相关下游通道改变情况，明确Integrinα2调控老龄骨质疏松患者BMSCs成骨分化分子机制。【方法】1、利用分层离心技术对捐献者骨髓细胞进行分离，培养后扩增，流式细胞技术对培养细胞的表面分子进行测定，诱导分化技术验证其向骨、脂肪分化的功能，MTT及CFU-F测定细胞增殖能力；2、利用RT-PCR方法检测骨疏及正常intergrinβ1，β3，α2，α5，αv表达情况差异，成骨诱导过程中β1，α2的变化同成骨相关基因（ALP/RUNX2/OSTERIX）变化相关性；3采用DNA连接技术、酶切鉴定技术等构建intergrin α2质粒，包装慢病毒后转染BMSCs，免疫荧光鉴定转染结果，优化转染条件以达到最大转染率；4、利用RT-PCR、MTT、流式细胞技术、细胞分化技术、免疫荧光技术、碱性磷酸酶染色、茜素红染色技术对转染后的BMSCs的生物学特性和成骨分化能力进行检测；检测转染后成骨诱导条件下ERK-p，Pi3K-p，P38、JNK相关信号通道同成骨活性的相关变化，并进一步检验及变化通道的上下游变化，通过干预上游信号验证关键通道。【结果】1．老龄骨疏患者BMSCs的分离、培养、鉴定及成骨能力检测采用密度梯度离心法分离了志愿者捐献的骨髓，15cm培养板贴壁培养后扩增，流式细胞技术检测培养细胞表达细胞CD135、CD105，不表达CD34、CD45，CFU-F实验证明其具有单细胞增殖能力，分化实验表明其能够向骨和脂肪组织分化，这些都表明老龄骨疏同非骨疏人间充质干细胞具有相同的细胞表型，均具有多向分化潜能，但骨疏患者的细胞增殖及成骨分化能力较弱。2．老龄骨质疏松患者BMSCs整合素表达特点我们检测发现老龄骨疏患者BMSCs β1，α2明显降低、诱导后3、7、14天β1，α2增高亦低于非骨质疏松者，且α2这种变化同成骨相关基因（ALP/RUNX2/OSTERIX）变化关系更紧密，这些结果提示：α2在成骨分化中有重要作用，老龄骨疏患者的α2缺陷是成骨能力降低的重要原因。3．成功构建带有α2的质粒，转染并稳定表达含上述基因的老龄骨疏患者BMSCsα2在成骨分化中有重要作用，因此上调老龄骨疏患者BMSCs上的α2可能促进BMSCs向成骨分化。构建带有α2基因的慢病毒，转染BMSCs发现α2表达增高，优化上述转染条件，使转染效率达到最高。4．体内外实验证明转染α2基因的老龄骨疏患者BMSCs的ERK基因表达上调，从而使成骨分化能力增强为检测骨质疏松患者BMSC整合素α2高表达对成骨分化的影响我们将转染和未转染细胞铺板，培养一周后加入成骨诱导剂，发现同野生型对比转染后RUNX2及Osterix表达明显增加，ALP活性平均增加43.6%(3days),58.03%(7days)和60.42%(14days)，同样的茜素红染色证明转染整合素α2可以增强骨疏BMSC的矿化能力，定量分析发现矿化能力增加了40.83%(14days)和54.79%(21days)。结果提示骨质疏松患者BMSC整合素α2高表达促进了细胞增殖及成骨分化。为了明确骨质疏松患者BMSC整合素α2高表达对成骨及增殖的影响的作用机制，我们检测了整合素下游信号通路ERK/AKT/JNK/P38的磷酸化状态，发现成骨诱导分化后转染组ERK在成骨诱导后30min快速活化。转染后RUNX2、ALP活性和茜素红染色增强可以被ERK通道阻滞剂PD98059所抑制。【结论】本研究发现老龄骨疏hBMSCs上Integrin α2的异常下调可以导致其增殖及成骨分化能力的降低。进一步的机制研究提示老龄骨疏患者BMSCs成骨及增殖缺陷可以通过高表达α2基因得到修复，Integrin α2活化了下游的ERK通道，从而使目的基因Runx2高表达来促进细胞的成骨分化。总而言之，我们的研究结果提示Integrinα2/ERK/Runx2信号通路在老龄骨疏发病中具有重要意义，该通路可能为本病的预防和治疗提供新颖的分子机制。