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[目的]
1.应用基因工程技术,初步实施hTNF-α靶向改造方案,将本课题组已经构建好的pET-32a(+)-collagen-MMP-hTNF系列质粒中的胶原蛋白(collagen)序列和明胶酶(MMP-2和MMP-9)底物序列分别用foldon序列和尿激酶(uPA)底物序列替换,构建出带有foldon序列,uPA底物序列和hTNF-α突变体基因的4种的pET42a(+)原核表达质粒(即pET42a(+)-foldon-uPA1-hTNF-α,pET42a(+)-foldon-uPA2-hTNF-α,pET42a(+)-foldon-uPA3-hTNF-α,pET42a(+)-foldon-uPA4-hTNF-α,并实现在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中的高效表达;
2.初步确立rhTNF-α融合基因表达产物的纯化的最佳方案,获得四种rhTNF-α融合蛋白的初步纯化产物。
3.验证尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)对融合蛋白的去封闭效果。
4.去封闭融合蛋白生物学活性的初步研究
[方法]
1.重组pET42a(+)-foldon质粒的构建
将foldon序列克隆至原核表达载体pET42a(+)中,筛选阳性重组子并进行DNA序列分析,筛选出序列正确的质粒并命名为重组pET42a(+)-foldon。
2.重组pET42a(+)-foldon-uPA-hTNF质粒的构建
1)用PCR方法扩增得到带有uPA底物序列和hTNF-α突变体基因的融合基因序列。
2)将扩增的融合基因序列产物克隆连接至pET42a(+)-foldon质粒中,转化,筛选阳性克隆。
3)对阳性重组子进行DNA序列分析,获得序列正确的带uPA底物序列和hTNF-α突变体基因的重组质粒,分别命名为重组pET42a(+)-foldon-uPA1-hTNF-α、pET42a(+)-foldon-uPA2-hTNF-α、pET42a(+)-foldon-uPA3-hTNF-α和pET42a(+)-foldon-uPA4-hTNF-α质粒。
3.重组pET42a(+)-foldon-uPA1-hTNF-α、pET42a(+)-foldon-uPA2-hTNF-α、pET42a(+)-foldon-uPA3-hTNF-α和pET42a(+)-foldon-uPA4-hTNF-α表达质粒在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中的表达
1)将重组表达质粒转化入大肠杆菌Rosetta2(DE3),筛选阳性重组子并进行DNA序列分析。
2)IPTG诱导阳性重组细菌表达目的蛋白。
4.表达产物的提取、纯化
1)按Novagen公司Bug8uster GST·Bind Purification Kits方法进行融合蛋白的提取和纯化。
2)SDS-PAGE分析表达产物和纯化产物。
5.uPA对融合蛋白的去封闭效果研究
用uPA分别酶切四种融合蛋白,SDS-PAGE鉴定酶切条带。
6.去封闭融合蛋白生物学活性的初步研究
以生理盐水为阴性对照和hTNF-α标准品为阳性参照,选取对切除GST标签的融合蛋白1(即foldon-uPA1-hTNF-α)、经uPA酶切后的去封闭融合蛋白1(即rhTNF-α),利用MTT法检测去封闭融合蛋白1的细胞毒性。
[结果]
1.应用基因克隆技术,成功构建foldon序列的表达质粒(pET42a(+)-foldon质粒),DNA测序结果显示,重组表达载体序列与理论序列完全吻合。
2.成功构建带有foldon序列和尿激酶(uPA)底物序列和hTNF-α突变体基因的4种表达质粒(重组pET42a(+)-foldon-uPA1-hTNF-α、pET42a(+)-foldon-uPA2-hTNF-α、pET42a(+)-foldon-uPA3-hTNF-α和pET42a(+)-foldon-uPA4-hTNF-α质粒),DNA测序结果显示,重组表达载体序列与理论序列完全吻合。
3.初步确立了4种重组表达质粒在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中的表达条件,并实现了四种rhTNF-α融合蛋白的高效、可溶性表达,获得4种rhTNF-α融合基因的表达产物。
4.确定了融合蛋白的纯化方案,成功切除了融合蛋白上的GST标签。
5.初步验证了uPA对融合蛋白的去封闭效果。
6.融合蛋白和去封闭融合蛋白能诱导高表达uPA的肿瘤细胞凋亡。
[结论]
利用基因工程技术对hTNF-α的结构进行了成功改造,初步探索了rhTNF-α在大肠杆菌Rosetta2(DE3)高效、可溶性表达的最佳条件以及表达产物的提取纯化方法。获得切除了GST载体标签的四种融合蛋白的三聚体化(活性形式)的纯化产物,验证了尿激酶(uPA)对融合蛋白的去封闭效果,融合蛋白和去封闭融合蛋白能诱导高表达uPA的肿瘤细胞凋亡。