基于酪胺信号放大的高灵敏免疫分析新方法研究

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建立高效、高灵敏的检测微量蛋白类肿瘤标志物的新方法对于疾病的早期诊断及治疗监测具有重要意义。高灵敏度的微量蛋白检测通常结合信号放大技术来实现。本论文基于酪胺信号放大技术(TSA)结合化学发光免疫分析与荧光免疫分析发展了两种高灵敏度检测癌胚抗原(CEA)和甲胎蛋白(AFP)的新方法,具体如下:一、基于酪胺-辣根过氧化物酶(tyramine-HRP)自组装的超灵敏化学发光免疫分析检测CEA。方法以CEA为研究模型,通过tyramine-HRP自组装结合化学发光免疫分析,实现了高灵敏度CEA检测。首先,通过点击化学反应制备了tyramine-HRP偶联物。然后,固定在微孔板内的捕获抗体Ab1与抗原CEA结合,再加入HRP标记的检测抗体Ab2,形成夹心免疫结构。随后,通过引入过氧化氢及tyramine-HRP偶联物,体系中的HRP催化酪胺衍生物沉积在相邻的蛋白上,并进一步形成HRP的组装。最后加入鲁米诺-过氧化氢发光溶液,在微弱发光测量仪上测定产生的化学发光信号。结果表明,基于TSA的蛋白检测与无酪胺放大的检测相比较,化学发光强度显著提高,大大提高了CEA检测的灵敏度,可检测低至1fg/m L的CEA,线性范围为1 fg/m L至10 ng/m L,为蛋白标志物的高灵敏度检测及疾病的早期诊断与治疗监测提供了一个简单、经济的通用检测平台。二、基于酪胺-共轭寡聚物纳米粒子(CON)的荧光免疫分析检测CEA和AFP。本文以CEA、AFP为研究模型,以酪胺-共轭寡聚物纳米颗粒作为荧光报告探针,建立了一种检测微量蛋白标志物的高灵敏、高通量的免疫分析新方法。首先,通过纳米共沉淀法制备了一种叠氮功能化的荧光CON。然后,利用点击化学反应使二苯基环辛炔-琥珀酰亚胺酯(DBCO-NHS)修饰的酪胺连接在CON表面,制备了酪胺修饰的CON(CON-tyramine)。在目标蛋白存在下,免疫反应在96孔微孔板中特异性地进行。随后,抗体上修饰的HRP催化许多CON-tyramine沉积到邻近蛋白上,引发TSA反应,结合荧光检测实现了CEA和AFP的高灵敏度、高通量检测。该方法可灵敏地检测低至10 fg/m L的CEA和AFP,线性范围可达4个数量级,为疾病的体外诊断提供了一种通用检测技术。
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