【摘 要】
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背景酒精性肝病（Alcoholic liver disease,ALD）是世界范围内常见的慢性肝脏损伤类疾病,长期过量饮酒损伤肝脏,伴有炎症反应,可以发展为酒精性肝炎、纤维化、肝硬化甚至是肝癌。枯否细胞（肝巨噬细胞）的活化在酒精性肝损伤中发挥着关键作用,研究表明酒精及其代谢物的积累损伤肝细胞,激活肝巨噬细胞或者引起肠道稳态失调,使细菌来源的脂多糖转移到肝脏,加剧巨噬细胞炎症反应再次损伤肝细胞。近年
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背景酒精性肝病（Alcoholic liver disease,ALD）是世界范围内常见的慢性肝脏损伤类疾病,长期过量饮酒损伤肝脏,伴有炎症反应,可以发展为酒精性肝炎、纤维化、肝硬化甚至是肝癌。枯否细胞（肝巨噬细胞）的活化在酒精性肝损伤中发挥着关键作用,研究表明酒精及其代谢物的积累损伤肝细胞,激活肝巨噬细胞或者引起肠道稳态失调,使细菌来源的脂多糖转移到肝脏,加剧巨噬细胞炎症反应再次损伤肝细胞。近年文献报道,酒精可直接活化肝巨噬细胞,发生炎症反应,分泌大量的炎症因子,引起肝脏损伤,加速酒精性肝病的进展。含双溴和溴外结构域蛋白（BET Bromodomain and Extra-Terminal Domain protein）家族蛋白BRD2（Bromodomain-containing Protein 2）因其在炎症相关基因转录调控中的关键作用备受关注。研究表明BRD2参与多种炎症反应性疾病的调控,且敲低BRD2基因表达,巨噬细胞中炎症因子分泌减少,炎症反应减弱。因此本课题主要研究BRD2蛋白在酒精性肝损伤中对酒精诱导的肝损伤、脂肪变性、巨噬细胞炎症反应的调控作用和机制,为酒精性肝病的防治提供一个新的策略。目的:探究BRD2在酒精诱导的急性肝损伤小鼠模型中对肝损伤、脂肪变性以及巨噬细胞炎症反应的调控作用和机制。方法:体内实验,雄性C57BL/6J小鼠按照随机原则分成6组:对照液体饲料组（pair-fed）,酒精液体饲料组（Eth-fed）,对照液体饲料+腺病毒空载体组（pairfed+Ad-GFP）,酒精液体饲料+腺病毒空载体组（Eth-fed+Ad-GFP）,对照液体饲料+腺病毒BRD2沉默组（pair-fed+Ad-BRD2-GFP）和酒精液体饲料+腺病毒BRD2沉默组（Eth-fed+Ad-BRD2-GFP）。根据高斌模型法,小鼠先进行五天的适应期喂养,第六天开始模型期,酒精液体饲料组小鼠喂食含5%酒精的酒精液体饲料,对照组继续喂食对照液体饲料,持续十天,最后一天早九点酒精液体饲料组小鼠灌胃浓度31.5%酒精,剂量5 g/kg;对照液体饲料组小鼠灌胃等剂量的生理盐水,九小时后处理小鼠,收集肝脏组织和血清,提取分离肝巨噬细胞。通过组织病理学（HE染色,油红染色）、血清学（ALT、AST含量测定）、肝体比、ELISA、蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR方法检测酒精诱导的急性肝损伤小鼠肝脏损伤和炎症因子分泌情况。体外实验,100 m M酒精刺激RAW264.7细胞建立体外炎症反应模型,首先检测不同时间点BRD2蛋白表达情况;蛋白免疫印迹和免疫荧光染色实验验证BRD2基因表达;其次腺病毒沉默BRD2基因表达、抑制剂JQ1阻断BRD2基因表达以及质粒p EX-3-BRD2过表达BRD2基因,蛋白免疫印迹实验检测BRD2基因是否被成功修饰、实时荧光定量PCR和ELISA实验检测炎症因子表达情况,最后免疫蛋白印迹检测NF-κB通路关键蛋白的表达水平。结果:体内实验结果:病理学染色和血清学检测结果,对照液体饲料组肝脏结构完整,仅有极少量脂滴堆积,酒精液体饲料组小鼠肝损伤明显,肝细胞出现不同程度破坏,细胞核消失情况,说明酒精性肝损伤小鼠模型建立成功。F4/80染色显示酒精液体饲料组巨噬细胞浸润增多,ELISA实验检测到炎症因子分泌增多,说明酒精诱导巨噬细胞活化,发生炎症反应;蛋白免疫印迹实验检测到BRD2在原代肝巨噬细胞和肝组织中表达显著升高;小鼠体内用腺病毒沉默BRD2基因后,肝损伤症状减轻,炎症因子分泌也减少,说明沉默BRD2基因有助于改善酒精性肝损伤。体外实验结果:100 m M酒精刺激RAW264.7细胞12小时,BRD2的表达显著升高;细胞上用腺病毒沉默BRD2基因或者抑制剂JQ1阻断BRD2基因表达,炎症因子分泌减少;而质粒p EX-3-BRD2过表达BRD2基因后,炎症因子表达不能被抑制;蛋白免疫印迹检测证明NF-κB信号通路受BRD2基因调控。结论:BRD2参与调控NF-κB信号通路调控酒精诱导的急性肝损伤巨噬细胞炎症反应。
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