论文部分内容阅读
志贺氏菌属细菌属于肠道致病菌,可引起临床上严重的腹泻。目前志贺氏菌的检测方法有:常规检测方法、分子生物学检测方法、毒素检测以及免疫学检测方法等。常规检测方法虽然准确性好,但所需时间长;分子生物学方法快速、灵敏、特异性强,且适用于不常见或新的病原微生物的检测,但成本较高,且要求较高的技术水平;VITEK(全自动细菌生化分析仪)、VIDAS(全自动免疫分析仪)等虽然快速准确、检测量大,但仪器费用颇高;免疫学中ELISA方法,具有操作简便、快速、灵敏的优点而广泛应用于致病菌的检测。本文通过对热灭活的抗原免疫新西兰大白兔,制备的抗血清,通过间接ELISA方法测得抗体效价,发现免疫家兔50d后抗体逐渐上升,最终抗体效价为1:51200,采用辛酸-硫酸铵方法纯化抗体得到纯度较高的IgG。通过对间接ELISA反应条件的系列摸索,确定了各组分的最适工作条件。试验结果表明,Costar公司生产的酶标板的变异系数为9.3%,达到ELISA的要求;最适封闭条件为5%脱脂牛乳,37℃,1h;抗体最适浓度为1.25μg/mL;抗体和HRP羊抗兔IgG的反应时间均为37℃,1h;间接ELISA方法底物在室温显色5min,志贺氏菌检测灵敏度为10~5～10~6cfu/mL。通过对Dot-ELISA系列反应条件的摸索,确定了各组分的最适工作条件。试验结果表明:最适封闭条件为5%脱脂牛乳,37℃,1h;抗体最适浓度为2.5μg/mL;抗体和HRP羊抗兔IgG的反应时间均为37℃,1h;底物在室温显色15min,Dot-ELISA检测志贺氏菌检测灵敏度为10~6cfu/mL。阻断试验和交叉试验表明抗体不与沙门氏菌、变形杆菌、单增李斯特菌、金黄葡萄球菌、大肠杆菌、芽孢杆菌反应,具有良好的特异性。本研究建立的检测方法,为志贺氏菌的检测提供了行之有效的技术手段。