吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)是一种三环邻醌,具有水溶性和热稳定性,属于继吡啶核苷酸(如NAD+)和黄素依赖性辅助因子(如FAD)后的第三类新型苯醌类辅助因子。醌依赖型葡萄糖脱氢酶则是以PQQ为辅酶,是除NAD和FAD依赖的葡萄糖脱氢酶外的一种新型葡萄糖脱氢酶,多存在于革兰氏阴性细菌中。为了研究Serratia sp.FS14中醌依赖型葡萄糖脱氢酶及其生理功能,本研究首先通过对FS14的基因组进行了序列分析,发现了三个可能的葡萄糖脱氢酶基因,分别为12765、13040和20445。为了确认这三个基因编码的蛋白为葡萄糖脱氢酶,本研究通过无痕突变的方法分别构建了这三个基因分别突变的单突变株、两两突变的双突变株和三个基因全部突变的三突变株,并分别在甘油蛋白胨和加2%葡萄糖的甘油蛋白胨培养基中测定培养基的pH值。结果表明,在2%葡萄糖的甘油蛋白胨培养基中,野生型FS14、单突变株和双突变株培养基pH均明显下降,且发现葡萄糖抑制灵菌红素合成效应。而在三突变株中,培养基pH和灵菌红素产量均不降低。由于PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶可以将葡萄糖氧化成葡萄糖酸,引起培养基pH的下降,导致灵菌红素合成降低,这说明三突变株不能合成或极少量葡萄糖酸,进而不能抑制灵菌红素的合成。研究显示,FS14的PQQ缺失突变株是不能氧化葡萄糖产酸的,因此这个结果进一步说明这三个基因编码的蛋白应该均是PQQ依赖的葡萄糖脱氢酶基因。但是,由于某些原因,除13040基因回补成功,另两个基因均未回补成功。为了进一步明确这些蛋白是醌蛋白葡萄糖脱氢酶及醌蛋白葡萄糖脱氢酶的作用机制,本研究还以FS14的总DNA为模板,通过PCR的方法,分别扩增12765、13040和20445的基因,并在E.coli C43(DE3)中异源表达,并获得了高纯且聚合状态单一的20445蛋白。将纯化的20445蛋白筛选结晶条件并优化蛋白晶体。在4℃,0.1 M柠檬酸钠pH6.0,27%PEG4000和0.1M calcium chloride条件下得到了较好的晶体,通过X-射线衍射的方法收集到1.33 A的衍射数据,最后通过分子置换的方法解析了20445蛋白晶体的三维结构。20445晶体的空间群是P121,每个不对称单元中含有2个20445分子。20445蛋白结构拥有醌依赖型葡萄糖脱氢酶家族所特有的结构:6个β折叠区围成的筒状结构,而每个β折叠区由4个反向平行的β折叠片组成,每个β折叠片之间由长短不一的无规卷曲组成且α螺旋比较少。结构比较表明:20445和E.coil、Acinetobacter calcoaceticus中相应的醌依赖型葡萄糖脱氢酶的结构非常相似,且在活性中心的氨基酸绝大部分是保守的。因此,我们认为沙雷氏菌中20445的确是一种醌依赖型葡萄糖脱氢酶。