【摘 要】
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CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)基因编辑神器,被认为是遗传领域的革命性技术,近几年这项技术飞速发展并很快就席卷了国内外科研界。CRI
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CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)基因编辑神器,被认为是遗传领域的革命性技术,近几年这项技术飞速发展并很快就席卷了国内外科研界。CRISPR可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因,所以是一种很精确的基因敲除和敲入的研究技术。斑马鱼作为经典的实验模式动物被用于遗传学和分子生物学等研究领域具有自身优势特点,所以本文选择在斑马鱼体内进行CRISPR打靶实验。pygo1基因是本实验室前期已鉴定出的人类心脏发育候选基因,目前国际上尚无该基因的斑马鱼敲除品系的建立及相关功能的报道。为探究该基因在心脏发育方面的生物学功能,本文利用CRISPR/Cas9基因敲除技术进行斑马鱼pygo1基因敲除系的构建。首先通过一些专门的网站对pygo1基因功能结构域进行分析,并分别在该基因的一号外显子,一号外显子和一号内含子之间、二号外显子设计了特异性较好的4个g RNA,并将这4个g RNA进行转录合成。然后分别将g RNA与h Cas9共注射到处于一细胞期的斑马鱼胚胎细胞中,培养48h后收集胚胎提基因组进行敲除有效性分析,将具有敲除有效性的胚胎养三个月再分别进行剪尾鉴定,成功得到两条F0代阳性嵌合体。然后将筛到的这两条F0代阳性嵌合体分别与异性野生型斑马鱼进行杂交得到大量后代,养大至三个月后进一步筛选鉴定。经过一系列筛选鉴定工作后,挑选出有基因突变的一种F1代杂合体。然后继续将F1代杂合子中基因突变一致的雌雄个体自交得到F2代纯合体。目前已得到缺失5bp的斑马鱼稳定敲除模型。为后续利用斑马鱼pygo1基因敲除稳定系研究该基因的生物学功能以及在心脏发育中扮演的角色奠定了基础。
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