背景:骨关节炎（osteoarthritis,OA）是一种以软骨退变、软骨下骨硬化、骨赘形成等为病理特征的疾病,是导致成年人发生残疾的主要原因之一。异常升高的活性氧（reactive oxygen species,ROS）是导致OA发病的重要因素之一,ROS不仅能激活下游炎症反应,而且可以诱导软骨基质降解。褪黑素（melatonin,MT）作为一种具有抗炎症和抗氧化功能的内源性激素,近年来已证实可促进软骨组织的修复与再生,但是褪黑素能否保护OA情况下的关节软骨尚不得而知。核因子 E2 相关因子 2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2,NRF2）是一种调控细胞内抗氧化酶表达的关键转录因子,对维持软骨基质稳态（基质合成和基质分解平衡）起着重要作用。血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）是NRF2信号通路的重要下游靶点,在维持细胞氧化还原平衡、免疫调节、抗炎症以及抗细胞凋亡中发挥着重要作用。MicroRNAs（miRNAs）是一类短链非编码RNA分子,在进化上具有高度保守性,其主要功能是在转录后水平调控基因表达。相关文献报道,miR-146a可调控NRF2的蛋白合成,但是miR-146a是否参与OA诱导的软骨退变尚不明确,同时目前也缺少关于褪黑素调控miR-146a以及软骨细胞氧化还原平衡的研究。目的:阐明褪黑素调控软骨细胞抗氧化功能以及维持软骨基质代谢稳态的作用机制,探究miR-146a/NRF2/HO-l信号轴在褪黑素抗关节炎中的作用,明确关节腔注射褪黑素能有效保护大鼠OA软骨组织。方法:20只8周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠,随机分为假手术组（Sham组）和OA造模组。OA造模组行内侧半月板失稳术（destabilization of medial meniscus,DMM）构建大鼠OA模型。术后1个月,分别从Sham组和OA造模组（DMM组）中提取正常与OA软骨细胞,传至第2代进行相关实验。体外细胞实验:（1）比较正常与OA软骨细胞在细胞形态、增殖能力、基质合成能力、基质降解水平以及抗氧化功能等方面的差异;（2）在培养OA软骨细胞时加入不同浓度的褪黑素,通过光学显微镜观察细胞形态,细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖能力,实时RT-PCR和蛋白免疫印迹检测软骨基质合成与降解相关产物（Collagen Ⅱ、Aggrecan、MMP13、ADAMTS5）以及 NRF2 及其下游抗氧化酶（SOD1、SOD2、Catalase、HO-1）在mRNA和蛋白质水平的表达情况,并利用荧光探针2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）检测软骨细胞内活性氧水平;（3）利用微阵列芯片技术筛选差异表达的microRNA,并通过实时RT-PCR验证miR-146a的表达情况;（4）利用小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）沉默Nrf2基因表达,并利用mimics过表达miR-146a,进一步研究miR-146a/NRF2信号轴在褪黑素保护关节软骨中的作用。体内动物实验:（1）为研究关节腔注射褪黑素对关节软骨退变的影响:24只8周龄雄性SD大鼠随机分为4组,每组6只,分别为Sham组、Sham+MT组、DMM 组、DMM+MT 组。DMM 术后 1 周,sham+MT 与 DMM+ MT 组关节腔注射100 μL褪黑素溶液（10 mg/mL）,其余两组关节腔注射等剂量的无菌生理盐水;（2）为进一步研究miR-146a在OA软骨退变中的作用:18只8周龄雄性SD大鼠,随机分为3组,每组6只,分别为MT组、MT+NC组、MT+mimics组。DMM术后1周,MT组关节腔注射100 μL褪黑素溶液,MT+NC组和MT+mimics组关节腔注射等剂量含NC或miR-146a mimics（250 μM）以及褪黑素（10 mg/mL）的混合溶液。每周注射2次,持续4周,术后第5周处死动物。利用苏木素-伊红、番红O-快绿染色对各组关节软骨进行组织学分析,并通过ImageJ软件测量软骨厚度,同时根据OARSI标准对关节软骨进行评分。结果:在体外实验中,与正常软骨细胞相比,OA软骨细胞的增殖能力有所提高,但基质合成能力下降、基质降解水平升高、抗氧化能力下降。褪黑素干预对OA软骨细胞的细胞形态无显著影响,但抑制其增殖能力。褪黑素以剂量依赖性方式提高OA软骨细胞的基质合成能力并降低基质降解水平,表现为软骨基质collagen Ⅱ和aggrecan的表达水平显著上调,同时基质降解酶MMP13和ADAMTS5的表达水平显著下调。褪黑素显著提高OA软骨细胞的抗氧化能力,表现为细胞内ROS水平显著下降,HO-1的表达水平显著上调。在褪黑素干预下,虽然Nrf2的基因表达无显著变化,但其蛋白表达水平上调了 71.8%。siRNA沉默Nrf2表达后,褪黑素的软骨保护作用和抗氧化作用被显著抑制,表现为collagen Ⅱ和aggrecan的表达水平显著下调、MMP13的表达水平显著上调、细胞内ROS水平显著升高以及SOD1、SOD2、Catalase、HO-1的表达水平显著下调。microRNA微阵列芯片总共筛选出25个差异表达的microRNA。实时RT-PCR进一步证实OA软骨细胞内miR-146a的表达水平较正常软骨细胞升高了 3.4倍。褪黑素干预后,miR-146a的表达水平下调33.4%。转染mimics过表达miR-146a后,褪黑素的软骨保护作用和抗氧化作用被显著抑制。同时,过表达miR-146a后,NRF2的蛋白表达水平下调32.0%。在体内实验中,关节腔注射褪黑素能够有效改善OA大鼠的关节软骨退变。组织学分析显示,DMM+MT组软骨表面糖胺聚糖的丢失较DMM组显著减少。Sham组的OARSI评分结果为0.8±0.8,而DMM组的评分结果升高至6.2±1.6。经关节腔注射褪黑素治疗后,DMM+MT组的OARSI评分结果较DMM组降低54.1%。软骨厚度测量结果显示,DMM组的软骨厚度较Sham组降低39.6%。经关节腔注射褪黑素治疗后,DMM+MT组的软骨厚度较DMM组增加40.9%。外源性注射miR-146a mimics后,褪黑素的软骨保护作用受到显著抑制。组织学分析显示,MT+Mimics组软骨表面糖胺聚糖的丢失较MT+NC组显著增加。MT+NC组的OARSI评分结果为3.2±0.8,而MT+Mimics组的评分结果升高至5.2±0.8。软骨厚度测量结果显示,MT+Mimics组的软骨厚度较MT+NC组降低32.1%。结论:褪黑素能有效提高关节软骨的基质合成能力、抑制基质降解、延缓骨关节炎的进展。褪黑素的抗关节炎效果是通过抑制miR-146a表达,从而在转录后水平提高NRF2表达,进而增强软骨细胞的抗氧化功能实现的。褪黑素激活的miR-146a/NRF2/HO-1信号轴有助于减缓OA大鼠的软骨退变。