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前言 抑癌基因功能的丢失可通过多种途径，除基因突变和杂合性丢失以外还与DNA甲基化修饰有关，肿瘤的发生、进展与DNA甲基化的关系已成为当今肿瘤遗传学研究热点之一。目前发现许多肿瘤相关基因的失活都与甲基化有关，例如P16、E-cadherin、RB1、BRCA1、HMLH1、MGMT等。E-cadherin是与肿瘤转移相关的基因。1998年Guilford等在新西兰发现三个伴有E-cadherin基因生殖系突变的胃癌家系，引起了许多胃癌研究者的注意，但研究者发现在散发性胃癌中E-cadherin基因突变率并不很高，有人认为散发性胃癌与甲基化关系更为密切。由于胃癌的发生是一个复杂的多基因、多阶段相互作用的结果，研究基因在胃癌不同发展阶段中的作用对阐明胃癌发生的机制将有重要意义。因此，我们对不同地区(高发区和非高发区)、不同发展阶段(异型增生、早期胃癌、进展期胃癌)的胃癌标本，进行了E-cadherin基因突变检测、启动子甲基化状况以及E-cadherin蛋白表达的分析，较系统地研究了E-cadherin基因突变及甲基化在胃癌发展中的作用。 材料和方法 1．标本：早期胃癌石蜡切片标本70例，异型增生石蜡切片标本40例，进展期胃癌冰冻及石蜡标本20例，所有标本均来自于中国医科大学肿瘤科。 2．石蜡标本DNA提取：石蜡切片(5μm)二甲苯脱蜡后，直接用蛋白酶K消化，提取DNA。冰冻组织标本DNA提取：饱和NaCI法。 3．E一比dherin基因突变检测：采用变性梯度凝胶电泳及测序的方法进行突变检测。 3．IPCR扩增：设计含GC夹的6，7，8，9外显子引物，弓物序列分别位于6，7，8，9外显子两侧的内含子内。 3．2 垂直变性梯度凝胶电泳（DGGE人检测每对引物最适解链条件（变性浓度人 s．s 平行变性ncc巴根据垂直nccz检测的解链区域的变性浓度，制备相应变性浓度的平行变性梯度凝胶，对每个样本进行突变检测。 3．4 测序：有泳动变位的样本，胶回收试剂盒回收纯化后用ABI PRISM 310 Genetic Analyzer进行测序。 3．E－cadherin启动子区甲基化检测 采用甲基化特异性 PCR方法：Methyation－sPecific PCR（MSP人对进展期胃癌20例，异型增生23例，早癌癌旁10例，早期胃癌20例进行检测。甲基化酶处理的和未处理的正常人骨髓细胞分别为阳性和阴性对照。 4．E．cadherin蛋白表达检测 用于 E－cadherin启动于甲基化检测的标本同时用免疫组织化学方法分析E—cadherin蛋白表达水平，采用链霉菌抗生物素蛋白一过氧化酶染色法。 实验结果 l．E—caMen二基因突变 发现1例进展期胃癌E－cadherin基因的突变，该突变是一个新的突变，其432位密码的第三个碱基C—G，导致天门冬酚胺一赖氨酸（AAC—AAG人 ·2· 2．E—ca仙erin启动于甲基化状况 ”E化adheriti基因启‘动子在异型增生、早期胃癌和进展期胃癌中均显示有甲基化修饰，其阳性率分别为 78．3％O8／23），80％O／20入90％O L经X‘检验各组与正常组（42．9％）比较均有差异（P＜o．05），但各组间没有差异（P＞o．05）。 3．免疫组化分析结果 20例进展期胃癌E－cadherin蛋白全部阴性O％L20例早期胃癌中14例阴性问％X6例阳性，23例异型增生标本E－cadherin蛋白表达无阴性（0阮）。 讨 论 本实验在进展期胃癌中检测到一例第9外显子的点突变，在早期胃癌和异型增生中都未发现，在进展期胃癌中检测到的这例突变是一个新的有意义的突变，该突变位于细胞外第三个同源结构域内，其第432位密码子由天门冬酸胺一赖氨酸（AA C—AAG厂从而影响细胞外结构域的粘附功能。该突变的发现与本实验中采用的变性梯度凝胶电泳的检测方法有关，由于PCR－DGGE检测突变需要特殊设计带“GC”夹的引物，所以该方法的使用很受限制，我们首次将变性梯度凝胶电泳的方法用于E－cad－herin基因突变的检测上，实践证明该方法简便可行，DGGE方法能够检出任何一种点突变。在异型增生阶段、早期胃癌和进展期胃癌发现DNA甲基化的几率都很高，说明E－cadherin启动子甲基化存在于癌前及发展的各个阶段，是胃癌发生、进展的重要事件。虽然一些基因的甲基化与基因沉默有关，去甲基化与基因的表达有关，但并不是所有的基因都严格地保持着这种平行关系，所以分析DNA甲基化与蛋白表达的相关性非常必要。在我们的实验中早期胃癌和进展期胃癌蛋白表达减弱与其甲基化明显相关，E－cadherin蛋白在早期胃癌就有明显的表达抑制个 人在进 ·3·展期胃癌中表达全部阴性；但同时也发现异型增生阶段有甲基化，蛋白表达却全部阳性，这可能与甲基化的密度有关，一些研究表明弱的启动子能被密度较低的甲基化完全抑制，当启动子由增强子增强时，恢复转录功能；如果甲基化的密度进一步增加，转录也进一步被完全抑制。本实验在增生阶段转录功能较强，甲基化可能?