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目前,在集约化养殖生产中,养殖鱼类常出现生长慢、应激及免疫功能低下等问题,严重困扰了水产养殖业的健康与可持续发展。因此,寻找调节养殖鱼类免疫、炎症反应的分子机制尤为重要。研究发现,miRNAs通过调节自噬在维持机体的代谢及免疫反应中发挥重要作用。在哺乳动物和部分鱼类中的研究已证明miR-33参与多个脂代谢调控环节(胆固醇稳态、脂肪酸氧化、甘油三酯代谢)以及免疫过程。本课题组在前期的研究中也发现,草鱼miR-33过表达可上调肝脏(肝细胞)中生脂基因及促炎因子的表达,并可能和自噬作用相关。基于已有的研究,本实验以草鱼肾脏细胞系(CIK)为材料,首先通过饥饿、添加自噬抑制剂氯喹(CQ)以及脂多糖(LPS)等处理细胞,分析miR-33是否与草鱼CIK细胞中自噬及免疫功能有关,然后通过miR-33 mimic/inhibitor转染CIK细胞、miR-33 inhibitor+CQ共转染CIK细胞、miR-33的靶基因鉴定、Atg5基因超表达和干扰等技术,深入研究miR-33调节草鱼CIK细胞自噬和免疫功能的分子机制。研究结果不仅可以明确草鱼miR-33调节自噬和免疫功能的作用机制,还可以为鱼类炎症的预防提供新思路。主要研究结果如下:(1)饥饿、CQ和LPS处理CIK细胞,检测miR-33、自噬及免疫相关因子的表达变化通过饥饿、CQ(50μM)处理CIK细胞,探讨自噬、miR-33和免疫之间的关系。结果发现,饥饿组自噬标志蛋白LC3B及自噬相关基因Beclin-1、Atg5、Atg7、Atg4C、LC3-1的表达量都显著增加(P<0.05),表明饥饿状态下CIK细胞自噬水平增加。CQ组与饥饿组的结果正好相反,提示CQ处理可导致自噬水平降低。此外,CQ组miR-33的表达量显著增加(P<0.05),促炎基因(TNFα、NF-κB、IL-1β、IL-6)的表达和炎症因子(TNFα、IL-6、IL-12和IL-1β)的生成显著增加(P<0.05),饥饿处理组与其相反,即饥饿条件下,可诱导草鱼CIK细胞发生自噬;CQ处理使CIK细胞自噬作用受到抑制;抑制CIK细胞的自噬时可增加细胞中促炎因子的分泌和miR-33的表达;而促进CIK细胞自噬功能时,炎性因子的含量变化发生逆转。通过LPS(10μg/m L)处理CIK细胞,探讨免疫、miR-33和自噬之间的关系。结果显示,LPS处理的细胞中促炎基因(TNFα、IL-8、IL-1β、NF-κB和IL-6)和炎症因子(TNFα、IL-6、IL-12和IL-1β)、miR-33及自噬相关基因(Atg5、Atg12、Atg4B、Beclin-1和LC3-1)的表达都显著提高(P<0.05)。LPS处理CIK细胞导致细胞中miR-33的表达量增加,并促进细胞炎症和自噬的发生。以上结果说明,miR-33参与草鱼CIK细胞的自噬及免疫过程。(2)miR-33 mimic/inhibitor调节草鱼CIK细胞自噬及免疫功能miR-33 mimic转染CIK细胞,发现miR-33的表达量显著增加,自噬标志蛋白LC3B及自噬相关基因(Beclin-1、Atg5和LC3-1)的表达显著降低(P<0.05),促炎基因(TNFα、IL-1β和NF-κB)和炎症因子(TNFα、IL-1β、IL-12和IL-6)的表达显著增加(P<0.05),即miR-33过表达抑制草鱼CIK细胞的自噬,并诱导了促炎因子含量的增加;miR-33inhibitor转染CIK细胞与miR-33 mimic转染细胞的结果相反。此外,LPS+miR-33 mimic加剧了细胞中的炎症反应,而用LPS+miR-33 inhibitor共处理细胞时,则显著逆转了由LPS所诱导的细胞炎症反应。即miR-33抑制时,可促进细胞自噬,并降低由LPS引起的CIK细胞的炎症反应。miR-33可以负向调节草鱼CIK细胞的自噬及免疫功能。为了验证miR-33是否通过调节自噬过程进而调控CIK细胞的免疫功能,实验用miR-33 inhibitor和CQ共转染CIK细胞。结果表明,miR-33 inhibitor+CQ组的促炎相关因子的表达量显著降低,免疫相关酶(AKP、SOD和CAT)活力显著增加(P<0.05),即当自噬被抑制时,miR-33 inhibitor仍可以下调促炎相关因子的表达,提高免疫相关酶活力。说明miR-33对免疫的作用不受自噬过程的影响。(3)miR-33靶向Atg5调节CIK细胞自噬及免疫功能的分子机制通过生物信息学和miRNA相关靶基因预测及双荧光素酶报告基因系统证明Atg5是miR-33的靶基因。进一步通过基因超表达和干扰技术研究Atg5在CIK细胞中对自噬和免疫的功能发现,超表达Atg5时可导致细胞中miR-33的表达量降低,自噬相关基因(Atg5、Beclin-1、Atg4C、LC3-1)的表达增加(P<0.05),此外,细胞中免疫相关酶(SOD和CAT)活力显著增加(P<0.05),促炎基因(TNFα、NF-κB、IL-8)的表达量和炎症因子(TNFα、IL-12和IL-1β)的分泌量显著降低(P<0.05),而Atg5干扰实验结果与Atg5超表达的结果相反。以上研究证明了Atg5是CIK细胞中调控自噬和免疫的关键基因,而miR-33则可以通过靶向Atg5调节CIK细胞的自噬及免疫功能。