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绵羊根据其生产方向不同,主要有产毛和产肉两个育种方向。新疆绵羊存栏量约为2600万,多数为粗毛品种,毛色多以棕红色为主,但也有黑色,青灰色和白色,含绒量55%以上,具有纺织价值。本研究以新疆本地品种周岁巴什拜羊棕红色和青灰色表型为研究对象,采用全基因组甲基化测序,检测两组表型皮肤组织的差异甲基化图谱,分析两组毛色中DNA甲基化对黑色素生成的调控机制;同时利用转录组测序筛选两组表型皮肤组织中差异表达基因,分析两种表型差异基因对色素沉积调控的分子机制;并对全基因组甲基化和转录组测序结果联合分析,获得差异甲基化和差异表达基因的调控关系,进一步深入了解DNA甲基化对基因表达调控影响毛色生成的分子机制。
1.全基因组甲基化分析结果显示,(1)两组表型在全基因组上CG类型的甲基化水平较高,且是绵羊DNA甲基化的主要类型,在CHH和CHG类型中,甲基化水平较低,两组之间甲基化水平和甲基化密度差异不显著。(2)基因组上所有基因不同功能区的DNA甲基化水平,CG序列背景下内在外显子和最后一个外显子DNA甲基化水平最高,基因上游区域和第一外显子处DNA甲基化水平最低,且在基因远端DNA甲基化水平高于基因近段,在CHG和CHH序列背景下,整体DNA甲基化水平较低,在CHH序列背景下内含子的甲基化水平相对最低。(3 )两组被毛表型DMRs数,CG类型在染色体上DMRs数量最多,5391个,且长度大小较为接近,DMRs长度在300bp以下;DMR基因注释结果显示在Intergenic区,基因body区和promoter在CG序列背景下,差异甲基化基因数目较多,而在5’UTR,1stExon和3’UTR区差异甲基化基因数目相对较少,且在CHG和CHH序列背景下,6个功能区域差异基因相对都很少。(4)差异甲基化相关基因GO和KEGG功能主要富集在经典Wnt信号通路的正调节(positive regulation of canonical Wnt signaling pathway),Ras信号通路(Ras signaling pathway)以及黑色素代谢通路(Melanogenesis)。
2.转录组测序分析结果显示,(1)发现棕红色和青灰色共计差异表达的基因共有1977个,在棕红色组中上调基因1298个,下调基因679个。(2)差异表达基因GO和KEGG功能主要富集在细胞组分(cell part ),膜(membrane ),生物调节(biological regulation)催化活性(catalytic activity)信号传感器活性(signal transducer activity )Wnt信号通路(Wnt signaling pathway ),Ras信号通路(Ras signaling pathway ),黑色素代谢(Melanogenesis )。(3 )并验证了TYRP1、DCT、PMEL、TYR、SLC45A2、MLANA、OCA2基因在两组表型皮肤组织的mRNA表达量,均在青灰色组中表达量高于棕红色组,与转录组测序结果一致。
3.全基因组甲基化和转录联合分析结果显示,(1 )在5个表达水平(low , medium_low,medium,medium_high ,high ),upstream区和靠近genebody基因区甲基化水对应5个表达水平依次降低。在genebody区和downstream区5个表达水平均是高甲基化水平。(2)两组毛色中所有差异表达基因在启动子区域有上、下调的基因共有113个,上调基因79个,下调基因34个;DNA甲基化与基因表达存在负调控的有55个,存在正调控的有58个。
4.候选基因WNT6、KIT、PMEL、DCT和RAB27A基因的启动子区CpG岛预测发现WNT6、KIT、PMEL基因启动子序列中均存在CpG岛;四组被毛表型(棕红色、黑色、白色和青灰色)5个基因启动子序列共检测到14个SNPs;转录因子结合位点预测结果显示,DCT、PMEL、RAB27A基因可能受到Pax-6、Zic、p300转录因子调控毛色的生成。
5.在细胞水平验证差异甲基化TSPAN10,EGFL6,SDR16C5,SLC5A10,GPR160基因,随着SGI-1027浓度增加,DNMT1,DNMT3A,DNMT3B基因表达量受到抑制,EGFL6基因和SDR16C5基因表达量逐渐升高,SLC5A10基因和GPR160基因表达量整体呈下降趋势,初步认为EGFL6,SDR16C5,SLC5A10,GPR160基因表达受到DNA甲基化的调控。
6.将转录因子Pax6过表达载体质粒转染至黑色素细胞中,荧光定量检测KIT、WNT6、RAB27A、PMEL基因表达量,初步验证Pax6基因对KIT、WNT6、RAB27A、PMEL基因表达有促进作用。转录因子Pax6对黑色素细胞的凋亡有抑制作用并能促进黑色素细胞中黑色素含量的增加。
1.全基因组甲基化分析结果显示,(1)两组表型在全基因组上CG类型的甲基化水平较高,且是绵羊DNA甲基化的主要类型,在CHH和CHG类型中,甲基化水平较低,两组之间甲基化水平和甲基化密度差异不显著。(2)基因组上所有基因不同功能区的DNA甲基化水平,CG序列背景下内在外显子和最后一个外显子DNA甲基化水平最高,基因上游区域和第一外显子处DNA甲基化水平最低,且在基因远端DNA甲基化水平高于基因近段,在CHG和CHH序列背景下,整体DNA甲基化水平较低,在CHH序列背景下内含子的甲基化水平相对最低。(3 )两组被毛表型DMRs数,CG类型在染色体上DMRs数量最多,5391个,且长度大小较为接近,DMRs长度在300bp以下;DMR基因注释结果显示在Intergenic区,基因body区和promoter在CG序列背景下,差异甲基化基因数目较多,而在5’UTR,1stExon和3’UTR区差异甲基化基因数目相对较少,且在CHG和CHH序列背景下,6个功能区域差异基因相对都很少。(4)差异甲基化相关基因GO和KEGG功能主要富集在经典Wnt信号通路的正调节(positive regulation of canonical Wnt signaling pathway),Ras信号通路(Ras signaling pathway)以及黑色素代谢通路(Melanogenesis)。
2.转录组测序分析结果显示,(1)发现棕红色和青灰色共计差异表达的基因共有1977个,在棕红色组中上调基因1298个,下调基因679个。(2)差异表达基因GO和KEGG功能主要富集在细胞组分(cell part ),膜(membrane ),生物调节(biological regulation)催化活性(catalytic activity)信号传感器活性(signal transducer activity )Wnt信号通路(Wnt signaling pathway ),Ras信号通路(Ras signaling pathway ),黑色素代谢(Melanogenesis )。(3 )并验证了TYRP1、DCT、PMEL、TYR、SLC45A2、MLANA、OCA2基因在两组表型皮肤组织的mRNA表达量,均在青灰色组中表达量高于棕红色组,与转录组测序结果一致。
3.全基因组甲基化和转录联合分析结果显示,(1 )在5个表达水平(low , medium_low,medium,medium_high ,high ),upstream区和靠近genebody基因区甲基化水对应5个表达水平依次降低。在genebody区和downstream区5个表达水平均是高甲基化水平。(2)两组毛色中所有差异表达基因在启动子区域有上、下调的基因共有113个,上调基因79个,下调基因34个;DNA甲基化与基因表达存在负调控的有55个,存在正调控的有58个。
4.候选基因WNT6、KIT、PMEL、DCT和RAB27A基因的启动子区CpG岛预测发现WNT6、KIT、PMEL基因启动子序列中均存在CpG岛;四组被毛表型(棕红色、黑色、白色和青灰色)5个基因启动子序列共检测到14个SNPs;转录因子结合位点预测结果显示,DCT、PMEL、RAB27A基因可能受到Pax-6、Zic、p300转录因子调控毛色的生成。
5.在细胞水平验证差异甲基化TSPAN10,EGFL6,SDR16C5,SLC5A10,GPR160基因,随着SGI-1027浓度增加,DNMT1,DNMT3A,DNMT3B基因表达量受到抑制,EGFL6基因和SDR16C5基因表达量逐渐升高,SLC5A10基因和GPR160基因表达量整体呈下降趋势,初步认为EGFL6,SDR16C5,SLC5A10,GPR160基因表达受到DNA甲基化的调控。
6.将转录因子Pax6过表达载体质粒转染至黑色素细胞中,荧光定量检测KIT、WNT6、RAB27A、PMEL基因表达量,初步验证Pax6基因对KIT、WNT6、RAB27A、PMEL基因表达有促进作用。转录因子Pax6对黑色素细胞的凋亡有抑制作用并能促进黑色素细胞中黑色素含量的增加。