鼻咽癌是一种上皮细胞恶性肿瘤，在全世界不同的地方其发病率具有较大的差异。2008年，全球新发鼻咽癌约84400例，死亡约51600例。与美洲、欧洲、非洲、中亚和东亚相比，东南亚具有最高的鼻咽癌发病率的报道。遗传异质性在鼻咽癌的发病中占据重要的作用，导致家族聚集的现象及发病率的显著地理位置分布差异。在鼻咽癌相关遗传因素当中，6号染色体6p21-3区域的HLA经典Ⅰ类基因与鼻咽癌呈显著相关。HLA经典Ⅰ类基因编码的细胞表面HLA-A、-B和-C分子能识别多样性的抗原肽并将其递呈到杀伤性T细胞。HLA基因序列的高度多态性也是细胞表面分子识别和递呈多样性抗原肽从而实现有效地免疫监视需要的体现。中国、中国台湾、新加坡等地的鼻咽癌HLA相关性研究中报道，HLA-A*11和B*13是鼻咽癌的抗性基因，而A*02(A*02:07)、A*33、B46和B*58则与鼻咽癌的高发风险相关。　　为了系统地对鼻咽癌的遗传因素进行探讨，课题基于广西鼻咽癌分子遗传学研究队列，综合性的进行了五个阶段的病例-对照研究：1)在鼻咽癌Ⅰ期研究队列中，通过PCR-SSOP基因分型方法，进行HLA与鼻咽癌相关性的研究；2)在分层随机抽样的1104例鼻咽癌Ⅱ期研究样品中，通过全基因组关联性分析研究的方法，在Affymetrix6.0基因分型平台对591458个SNPs进行检测，扫描疾病相关的基因区域；3)运用TaqmanSNP基因分型的方法在另一独立样品收集的队列中进行全基因组关联性研究结果的验证；4)通过基于测序的高分辨HLA基因分型方法，在两个研究队列中验证HLA等位基因及单倍体与鼻咽癌的相关性；5)通过HLA氨基酸多态性分析，精细定位鼻咽癌的主要相关性因子。　　课题研究总共包含4477例个体，来源于2000年4月-2001年6月(PhaseⅠ)及2004年11月-2005年10月(PhaseⅡ)的两个独立样品收集的队列。所有入组个体均为西江流域附近的汉族居民。　　根据第13届国际组织相容性工作组公布的操作规程，采用PCR序列特异性寡核苷酸探针的方法对鼻咽癌Ⅰ期研究队列包括鼻咽癌病例、健康对照以及他们的成年子女总共1407例个体进行了HLA高分辨基因分型，进而进行HLA与鼻咽癌的关联性分析。HLA等位基因分层分析结果显示，与鼻咽癌抗性相关的HLA保护性因子具有等位基因的独立性而与鼻咽癌发病风险相关的易感性因子则呈现单倍体依赖性。研究结果还首次报道了东南亚地区所特有的HLA-A2等位基因亚型A*02:06与鼻咽癌的高发风险相关。HLA-A*02:06、B*38:02、A*02:07-B*46:01及A*33:03-B*58:01共同构成鼻咽癌高发风险因子，合并比数比为2.6(p<0.0001)。与鼻咽癌低发风险相关的等位基因为HLA-A*11:01、B*27和B*55，合并比数比为0.42(p<0.0001)。鼻咽癌易感性HLA因子在广西鼻咽癌队列中高频率的分布状态亦提示HLA在鼻咽癌的区域性高发中的影响作用。　　应用Affymetrix Genome-wide SNP6.0基因分型平台对1104例分层随机抽样的鼻咽癌Ⅱ期研究队列样品进行了全基因组关联性分析。经过样品及SNP的质控筛选，567例鼻咽癌病例及476例对照的591458个SNPs进入了关联性分析。GWAS结果显示在6号染色体HLA区域具有很强的关联性，16号染色体及17号染色体附件也具有较强的相关性信号。位于21个基因区域附近的24个单核苷酸多态性位点在关联性分析中呈现出显著性的鼻咽癌关联性(p<5×10-5)，其中显著性最强的基因区域位于6号染色体6p21.3位置靠近HLA-A基因区域(rs417162，p=2×10-7.OR=0.6)。我们对我们研究组发现的鼻咽癌相关性SNPs位点及先前鼻咽癌全基因关联性研究文献报道的16个SNPs位点通过Taqman基因分型检测的方法在另一独立样品收集并已经完成HLA分型的：PhaseⅠ队列进行了验证。合并分析结果显示，在40个验证分析的SNPs当中，位于6号染色体上的6个SNPs与鼻咽癌发病的关联性具有基因组显著性水平(Genome-widesignificant，p<10-8)。　　HLA与疾病相关性的验证基于DNA测序的分型方法，我们完成了鼻咽癌Ⅱ期研究队列的3070例样品的HLA高分辨基因分型。DNA测序采用ABI的BigDye测序试剂和AB13730×1测序仪进行测序结果收集。采用Conexio Genomics公司的ASSIGN软件进行序列比对和结果判读。对于序列分析不能判读的杂合性等位基因组合则采用特异性引物扩增单一等位基因再进行测序的方法解决。HLA等位基因及单倍体与鼻咽癌及血清EB病毒IgA/VCA状态的相关性分析综合PhaseⅠ的分型结果一并进行，分析总共包含1405例鼻咽癌、1288例血清EB病毒IgA/VCA抗体阳性的对照及1362例血清EB病毒IgA/VCA抗体阴性的对照。HLA等位基因在鼻咽癌组和对照组之间呈显著性差异分布。三个HLA等位基因：HLA-A*11:01、B*38:02和B*55:02在鼻咽癌的关联性分析中差异最显著(p=1.7×10-19、p=7.0×10-11和p=1.6×10-10)。除了HLA-A和-B基因与鼻咽癌的较强关联性，HLA-C*12:02也呈现出中等强度的鼻咽癌关联性(p=4.3×10-5)。研究同时对通过家系确定的或群体数据推算的HLA-A-B-C单倍体与鼻咽癌的相关性进行了分析。三个易感性的单倍型HLA-A*02:03-B*38:02-C*07:02、A*02:07-B*46:01-C*01:02和A*33:03-B*58:01-C*03:02在病例及对照组中具有显著性的差异分布，同时我们也报道了两个显著性分布差异的鼻咽癌保护性单倍型：A*11:01-B*13:01-C*03:04和A*11:01-B*46:01-C*01:02。　　为了确认HLA与鼻咽癌相关关系中的驱动性信号，精细定位HLA相关性的主要因素，我们应用氨基酸多态性分析的方法去评估HLA的相关性是否能被特定的氨基酸功能性位点突变或它们的单倍体模式所解释。通过美国国立卫生院国立过敏及感染性疾病研究所开发的IMMPORT序列特性变异类型(Sequence Feature Variant Type，SFVT)分析软件我们对研究队列中HLA经典Ⅰ类基因的氨基酸变异类型进行了全面的分析，确定了285个HLA经典Ⅰ类基因的氨基酸突变位点。鼻咽癌相关性分析结果显示，位于HLA-A基因内第62位氨基酸谷氨酰胺与鼻咽癌的低发风险相关，病例-对照分析中呈现最显著性的差异(p=1.2×10-24，OR=0.59)。氨基酸多态性与鼻咽癌的相关性分析结果显著性差异远高于任何单一等位基因的显著性水平提示特定氨基酸突变位点是HLA与鼻咽癌相关性的主因。这一趋势同样体现在HLA-B及HLA-C基因的氨基酸多态性分析结果上，HLA-B中最显著性的位点为116位氨基酸(p=1.7×10-13，OR=0.65)而HLA-C基因中最显著性的位点是位于156位的氨基酸(p=1.4×10-9，OR=0.47)。在HLA经典Ⅰ类分子中，超过20个氨基酸突变位点的鼻咽癌相关性呈现出基因组显著性差异水平。与鼻咽癌发病风险最强的氨基酸突变位点均位于HLA分子的抗原肽结合凹槽部位，结果提示位于抗原结合凹槽部位的氨基酸多态性是鼻咽癌易感性或者抵抗性相关的主要影响因素。　　第62位HLA-A氨基酸Gln与鼻咽癌相关性的显著性水平在其与相邻HLA-A位点氨基酸突变作为协变量的时候，-Log10P值出现了大幅度降低，提示这些氨基酸多态性位点作为HLA-A62 Gln的代理信号与鼻咽癌呈现相关性，而且多个显著相关性位点在用62 Gln作为协变量时出现显著性丢失的现象提示在这些HLA-A基因位点的相关性来自于同一信号。以HLA-B和HLA-C基因区域内的其它鼻咽癌强相关的HLA因子作为协变量进行结果校正之后并未出现HLA-A62Gln信号衰减的现象也提示这一相关性因子独立于HLA-B或HLA-C的强相关性因子。与之相似的情况也出现在HLA-B基因位点(图3-13)，HLA-B与鼻咽癌的相关性可被至少两个氨基酸位点-16位的Leu和116位的Leu所代表，而且它们与鼻咽癌之间的相关性也独立于HLA-A和HLA-C的相关因子。HLA-B基因第116位氨基酸的单个氨基酸突变被确认为是易感性等位基因HLA-B*35在欧裔美国人的HIV感染者中显著的加快艾滋病疾病进程的遗传因素，这一氨基酸突变位置与鼻咽癌显著相关的位点相同提示HLA在抵抗EB病毒感染中可能存在相似的机制，从而显著影响鼻咽癌发生发展过程的进程。　　基于大样品量的广西鼻咽癌研究队列，我们的研究结果清楚的显示HLA经典Ⅰ类分子与鼻咽癌的强相关性。在HLA与鼻咽癌的相关性当中，我们提出了携带与鼻咽癌最显著相关的氨基酸突变类型的HLA-A*11:01作为作用等位基因而呈现出鼻咽癌的强相关性的HLA相关性机制。同时我们通过代理分析的方法确定了来源于HLA-A和HLA-B基因(代表等位基因：B*13:01、B*27:04和B*55:02)的两个独立性信号。检测出在HLA-B基因中，第116位氨基酸的突变与鼻咽癌低发风险具有最强的关联性，这一作用位点与易感性等位基因HLA-B*35在第116位氨基酸的单个氨基酸突变可显著的加快艾滋病疾病进程的作用位点吻合，提示在HLA抵抗HIV及EB病毒感染中可能具有相似的机制。所有这些相关性信号均达基因组显著性水平，并在我们的独立样品收集的研究队列及其他来源于亚洲的遗传相关性研究群体所验证。我们的研究表明了遗传因素与中国南方鼻咽癌的发病风险强烈相关，研究阐明了HLA等位基因及其抗原识别基序是鼻咽癌发病的主要遗传影响因素。