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目的本文基于对梯度浓度镁离子(Magnesium Ions,Mg2+)对人牙周韧带细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)成骨分化作用影响的现象探究,进一步从分子水平检测镁离子调控PDLCs成骨作用相关因子的作用规律,并从通路的角度进行了可能机制(Wnt通路)的初步探索,以期为镁离子向牙周组织再生治疗的临床应用进程推进提供理论基础及实验依据。方法取P3-P5代PDLCs进行接种,分别进行如下检测:(1)用CCK-8法检测1、3、5、7天各组PDLCs的增殖速度。(2)用碱性磷酸酶(ALP)活性检测法进行成骨诱导3、7天PDLCs的ALP活性定量检测。(3)用茜素红染色观察比较成骨诱导PDLCs 21天形成矿化结节程度。(4)用实时荧光定量PCR(Realtime PCR)检测成骨诱导后PDLCs于3、7、14天成骨相关基因ALP、Runx2、ColI、OPN的表达情况,并比较Wnt信号通路相关基因 Gsk-3β、Frizzled 3、LRP5、β-catenin、LEF1、Cyclin D1、Cmyc、DKK1的表达差异。统计学分析:本实验使用SPSS 20.0软件,两组间比较采用student t检验,多组比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P值<0.05,差异有统计学意义。结果(1)CCK-8实验结果显示:0-15 mmol/LMg2+处理组细胞持续增殖,20、40、50 mmol/L Mg2+处理组随浓度递增细胞生长速度于3天时持续减慢,差异有显著统计学意义。25 mmol/L Mg2+处理组第5天时速度显著减慢,第7天时增殖速度加快与对照组无明显差异。30 mmol/L Mg2+处理组第3天时速度显著减慢,第5天时增殖速度加快与对照组无明显差异。与对照组相比,5 mmol/L Mg2+组第7天细胞增殖速度升高及7.5 mmol/L Mg2+组第3、5天的细胞增殖速度升高有统计学意义。(2)ALP活性检测实验结果显示:PDLCs更换成骨诱导液后3天,15 mmol/L Mg2+处理组ALP活性显著高于其他各组,与对照组相比有显著统计学差异;50 mmol/L Mg2+处理组显著下调ALP活性。7.5、20 mmol/L Mg2+处理组ALP活性高于对照组,有显著统计学差异。PDLCs细胞成骨诱导第7天趋势与第3天类似,其中7.5 mmol/L Mg2+处理组ALP活性显著高于其他各组,有显著统计学差异。(3)茜素红染色结果显示:PDLCs进行成骨诱导21天后,对照组可见大量红色深染矿化结节,7.5 mmol/LMg2+处理组仅出现少量点状矿化颗粒,基础培养基培养组未见矿化迹象,差异有显著统计学意义。(4)实时荧光定量PCR:对照组成骨相关因子ALP、ColI及RUNX2第7天的表达水平均高于第3、14天,OPN在第3、7天维持较低表达水平,第14天显著上调。与对照组相比,7.5 mmol/LMg2+处理组的Runx2、ALP表达量于第3、7、14天持续上升且高于对照组,OPN表达持续保持偏低,有显著统计学差异,ColI差异无统计学意义。对照组Wnt信号通路相关因子Gsk-3β第7天表达下调,3、14天表达水平接近;β-catenin、Frizzled 3仅于14天时上调;LEF1、Cyclin D1、Cmyc基因于第3、7、14天表达持续上调;DKK1于第14天表达显著上调,LRP5的表达量第7天高于第3天,第14天低于第3天,有显著统计学差异。与对照组相比,7.5mmol/LMg2+处理组GSK-3β、Fizzled 3在3个时间点均无显著改变;LRP5于第3、7、14天表达持续下调;β-catenin、DKK1、Cyclin D1表达水平随时间逐步小幅度增高,LEF1、Cmyc在第3、7天无明显变化,第14天上调。结论7.5-15mmol/L浓度镁离子可提高PDLCs的ALP、Runx2表达水平并降低OPN表达量,PDLCs经镁离子处理后表达出的早期成骨因子上调、矿化程度降低的特殊性表现与Wnt信号通路激活抑制具有相关性。