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研究背景脊髓损伤作为临床常见中枢神经系统损伤,可导致损伤平面以下部分或完全的运动、感觉和自主神经功能障碍等严重后果。时至今日,通过复杂的治疗和强化的功能训练虽可带来少许的恢复,但治疗过程缓慢,效果有限,并对较严重的脊髓损伤作用十分有限。目前针对较严重的脊髓损伤来说临床上尚无可获得显著功能恢复的治疗手段。干细胞疗法可在实现结构修复的同时对功能恢复有所助益,目前作为脊髓损伤治疗的一个潜在手段被广泛关注。本研究将联合使用骨髓间充质干细胞和嗅粘膜来源神经干细胞进行脊髓损伤模型的联合移植治疗。试图使两种细胞优势互补,增强其治疗能力。其理论依据在于：由于骨髓间充质干细胞在脊髓损伤的急性期可以调节免疫反应,而神经干细胞可以促进神经元的修复和轴突的重新长出。第一部分：嗅粘膜来源神经干细胞和骨髓间充干细胞的提取和鉴定目的：使用水平振荡法提取大鼠骨髓间充质干细胞并对其纯度和分化能力进行鉴定；提取大鼠嗅粘膜来源的神经干细胞,并对其进行鉴定。方法：无菌条件下从股骨和胫骨中抽出骨髓腔内的骨髓,反复吹打将骨髓基质制成细胞悬液,离心后贴壁培养。将原代骨髓基质细胞放入恒温摇床内进行摇动4小时,弃上清后传代培养。使用流式细胞仪对获得的BMSCs的纯度进行鉴定,成骨成脂诱导培养证明其分化能力。无菌条件下剥离大鼠嗅粘膜组织,从中提取神经干细胞,培养后取神经球消化传代。使用免疫组化染色对所取细胞进行鉴定。结果：所获得的BMSCs, CD29和CD90的阳性细胞比例分别为99.1%和9.19%,而表达CD31和CD45的阳性细胞比率分别为0%和1.3%。经过成骨和成脂诱导培养后,可向成骨细胞和脂肪细胞分化,产生钙盐结节和脂滴。从嗅粘膜提取的神经干细胞培养时可呈典型的神经球,使用免疫荧光染色显示P75、S100、Nestin、 GFAP抗体阳性。结论：水平振荡法可高效稳定地获得大鼠骨髓间充质干细胞,减少传代培养次数,细胞纯度较高,具有分化潜能。从嗅粘膜提取的神经干细胞具有培养过程中具有神经球的典型特征,神经干指标鉴定阳性。第二部分：大鼠嗅粘膜来源神经干细胞和骨髓间充质干细胞共培养目的：分析大鼠骨髓间充质干细胞和嗅粘膜来源神经干细胞体外直接共培养后分泌神经相关营养因子的情况及对神经元抗凋亡能力的影响。了解大鼠骨髓间充质干细胞和嗅粘膜来源神经干细胞体外间接共培养后的相互作用情况。方法：将大鼠骨髓间充质干细胞和嗅粘膜来源神经干细胞体外直接共培养后,测定其上清液中神经营养因子-3(NT-3)和神经生长因子(NGF)的含量,并与单一细胞上清液进行比较。将BMSCs和ONSCs进行非接触共培养,使用荧光定量PCR测定共培养及单独培养条件下,两种细胞mRNA中Nestin、MAP-2、GFAP、Tuj1、 NSF-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13表达含量。提取胎鼠神经元细胞,使用炎症因子(IL-1β)对神经元进行刺激后,将神经元分别与BMSCs、OM-NSCs以及BMSCs混合OM-NSCs进行非接触共培养,使用TUNNEL和MAP-2免疫荧光染色测定神经元的凋亡率。结果：单独培养时,BMSCs培养上清液中含NGF最多含NT-3最少,而OM-NSCs中含NT-3最多而NGF最少,直接共培养后上清液的NGF和NT-3含量居中。经过共培养后BMSCs比单独培养时MMP-2. MMP-9和MMP-13表达量降低而MAP-2、GFAP、Tuj1表达量增高；Nestin先降低,后升高,而NSF-1先升高后降低。经过共培养后OM-NSCs比单独培养时NSF-1表达量降低而Nestin、MAP-2、 GFAP、Tuj1、MMP-2、MMP-9和MMP-13表达量增高。所有干细胞都会对降低炎症因子刺激后神经元的凋亡率,其中两种干细胞混合后的效果最为明显。结论：两种干细胞直接共培养后分泌的生长因子可互为补充。在非接触共培养条件下,BMSCs可以帮助OM-NSCs维持干性,OM-NSCs则会促进BMSCs的神经分化。OM-NSCs使得BMSCs迁徙能力下降,而BMSCs会促进OM-NSCs迁徒能力的提高。两种干细胞混合后,对神经元的抗凋亡能力的保护最为明显。第三部分：嗅粘膜来源神经干细胞和骨髓间充质干细胞联合移植在治疗大鼠脊髓损伤中的作用目的：观察嗅粘膜来源神经干细胞和骨髓间充质干细胞联合移植对大鼠脊髓损伤的治疗效果,并与骨髓间充质干细胞或嗅鞘细胞单独移植进行比较。方法：制备大鼠下胸段脊髓打击损伤模型。将造模的大鼠随机分为4组,组1,单纯BMSCs移植治疗组；组2,单纯ONSCs移植治疗组；组3,BMSCs和ONSCs共移植治疗组(两种细胞比例1：1)；组4,无菌PBS缓冲溶液注射阴性对照组。在造模后立即进行细胞移植,即在损伤部位周围注射4×104个细胞进行治疗。于细胞移植前、移植后第1天、第3天、第7天、第14天对大鼠进行运功功能评估。在移植后14天后处死大鼠,取脊髓病理标本进免疫荧光染色进行评估。结果：细胞移植后第14天,对照组、BMSCs移植组、OM-NSCs移植组和BMSCs+OM-NSCs移植组的BBB评分分别为5.6±0.8、7.6±1.1、9.6±1.5和10.8±1.3。其中治疗组的评分均较移对照组有明显改善。BMSCs和OM-NSCs联合移植组的BBB评分较两个单一干细胞移植组明显升高。免疫荧光显示移植的BMSCs和OM-NSCs均能迁移至脊髓损伤区,并能在损伤区存活。结论：大鼠嗅粘膜来源神经干细胞和骨髓间充质干细胞联合移植对脊髓损伤的治疗效果最好,骨髓间充质干细胞的存在有利于神经干细胞的迁移存活,以及进一步发挥神经修复功能。