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近年来,我国乃至全世界的香蕉生产面临多种病虫害的威胁,其中由土壤真菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyd.&Hans(Fac)引起的香蕉镰刀菌枯萎病是主要病害之一。目前已经发现了Foc的4个生理小种,影响我国香蕉生产的主要是1号和4号生理小种。由于目前在病区尚无行之有效的生物、化学防治方法,选育抗病/耐病品种被认为是是控制该病最安全和经济有效的措施。
系统获得抗性(systemic acquired resistance,SAR)是指植物由死体营养生物侵染或者局部组织经化学诱导物质处理后,导致植株未侵染和处理的部位对后续多种病原菌的侵染产生抗性。深入了解SAR的机制有着重要的理论和应用价值:通过利用植物免疫对病虫害进行防治,可以避免因大量施用农药对自然环境和人体健康带来的不利影响。目前国内外关于香蕉产生SAR的研究报道还很少。
本研究的目的首先是要建立香蕉-Foc互作的离体系统,并在该系统中用非亲和的Foc1号生理小种对感病的香牙蕉进行诱导接种,使其对后续接种的Foc4号生理小种产生SAR,同时从生理生化水平和分子水平研究SAR产生的机制。本研究取得的主要研究结果如下:
1.建立香蕉-Foc互作的离体系统。先将生根试管苗接种至改良培养基(mediumfor interaction system,MIS)进行预培养,再选取大小一致的小植株在无菌条件下接种Foc并放置在25℃的培养室中。由于碳源是Foc的首要生长限制因素,采用无蔗糖的MIS培养基可以在一定程度上降低Foc的生长量;另一方面,有叶片的香蕉生根小植株已经具备进行光合作用的能力,因而也能在MIS培养基上正常生长。为了验证该系统的可靠性,按照0-6级的病害评价等级对不同品种进行病害等级鉴定。研究结果表明:不同抗性水平的香蕉品种,其平均病害等级存在显著差异(P≤0.05),而且鉴定结果与田间的病害观察结果一致。
2.Foc非亲和小种诱导接种使香牙蕉产生SAR。利用香蕉-Foc互作的离体系统,在感病品种‘巴西’香蕉小植株的第2片叶接种Foc1号生理小种,使其对后续接种的Foc4号生理小种产生SAR。研究结果表明,诱导接种和挑战接种之间相隔5-15天时,处理小植株表现出不同程度的诱导抗性;当诱导接种和挑战接种相隔10天时,处理小植株的平均病害等级最低(1.67),接近现有香蕉枯萎病抗病品种(系)的抗性水平。同时本文的研究结果也证实产生SAR时,在诱导因子处理和挑战接种之间存在一个迟滞期。
3.Foc非亲和小种诱导接种对防御酶活性的影响。叶片接种Foc1号生理小种后10天,根系中苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia,lyase,PAL)、过氧化物酶(peroxidase,POD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)和超氧化物岐化酶(superoxidedismutase,SOD)等防御酶的活性最高,分别较相应的对照高出1.10倍、1.19倍、1.43倍和1.00倍。这与诱导接种后10天接种Foc4号生理小种产生的SAR最强的观察结果是一致的。
4.Foc非亲和小种诱导接种对内源水杨酸含量的影响。叶片接种Foc1号生理小种1天后,处理小植株的根系开始积累水杨酸(salicylic acid,SA),但SA含量与相应对照的差异不显著;诱导接种后2天和5天,根系SA含量提高至5.393和5.429μgg-1鲜重,分别比对照高出2.12倍和3.84倍;接着SA含量到第10天时开始下降。研究结果表明,内源SA的积累早于防御酶活性的提高和SAR的产生。
5.接种Foc1号生理小种诱导NPR1和PR基因的表达。叶片接种Foc1号生理小种6小时后,根系中MNPR1A和MNPR1B的表达均显著上调(P<0.01),这两个基因的相对表达量在第12小时下降,并在第12-48小时的范围内基本保持平稳。根系中PR-1和PR-3的表达不仅在诱导接种6小时后显著上调(P<0.01),而且在诱导接种24小时后再次显著上调(P<0.01)。由于MNPR1A和MNPR1B的表达上调发生在第6小时,而PR-1和PR-3的相对表达量在第12小时急剧下降,推测PR-1和PR-3第2次表达上调很可能是受到MNPR1A和MNPR1B的诱导。
本研究首次报道建立香蕉-Foc互作的离体系统。和目前常用的盆栽系统和水培系统相比,香蕉-Foc互作的离体系统是一个完全封闭的系统,而且香蕉小植株接种Foc后放置在环境条件较稳定的培养室中。该系统还可用于香蕉镰刀菌枯萎病抗病性的快速鉴定。目前香蕉枯萎病抗病育种的重点研究领域,例如离体选择、遗传转化和原生质体融合等均是以香蕉的细胞、组织培养作为基础。由于香蕉-Foc互作的离体系统直接对生根试管苗进行病害等级评价,不需要炼苗和移栽的过程,利用该系统进行抗病性鉴定有助于提高香蕉抗病育种的效率。
目前尚未见报道通过Foc非亲和小种诱导接种使香牙蕉对Foc4号生理小种产生SAR。本文的研究结果表明,利用Foc的非亲和小种作为诱导因子产生的诱导抗性是SA介导的SAR,在分子水平上与MNPR1A和MNPR1B表达上调及其后的PR-1和PR-3表达上调有关,在生理生化水平上与PAL、POD、PPO和SOD等防御酶活性的提高有关。
此外,本文的研究结果还间接支持以下结论:香牙蕉对产生SAR的信号转导途径不仅包括已经证实的SA依赖性途径(SA-dependent signaling pathway),还包括非SA依赖性途径(SA-independent signaling pathway);且产生SAR的信号转导途径与香牙蕉对Foc4号生理小种产生基础抗性的信号转导途径是一致的。
当Foc非亲和小种诱导接种与挑战接种的时间间隔为10天时,处理小植株的平均病害等级最低,接近现有香蕉枯萎病抗病品种(系)的抗性水平,说明通过产生SAR防治香蕉镰刀菌枯萎病是一个有前景的研究方向。