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目的：通过构建靶向PPARy基因的发夹状干扰RNA真核表达载体,经脂质体介导转染兔脂肪干细胞,评价RNA干扰PPARy基因对兔ADSCs成脂与成骨分化能力的影响,为下一步基因治疗骨代谢疾病奠定基础。方法：1.从GenBank上获取PPARy基因序列(AF013266),使用RNAstructure软件进行分析,筛选出四条特异性的序列作为位点和一个随机序列作为阴性对照,构建五个靶向PPARy基因pGPU6/GFP/Neo-shRNA表达载体(其中包括一个空载体组),经转化扩增后提取质粒进行酶切鉴定；2.将shRNA648, shRNA1344, shRNA1427, shRNA1815, shRNANC五个质粒载体分别转染ADSCs细胞,通过Real-time PCR筛选出干扰率最高位点,进行后续实验；3.取三月龄新西兰大白兔腹股沟脂肪组织进行脂肪干细胞提取并培养、扩增；4.利用脂质体转染剂RNAi-mate介导质粒载体pGPU6/GFP/Neo-sh1344转染至第三代ADSCs中,48h后荧光显微镜下观察转染细胞的绿色荧光数并计算出瞬时转染率；5.利用浓度400μg/ml的G418筛选转染后的ADSCs细胞,使用Western-blot检测G418筛选后的稳定转染细胞组、空载体组和空白对照组PPARy mRNA的相对表达量；6.通过MTT法绘制转染组(sh1344)与空白对照组ADSCs的生长曲线;7.转染组、空载体组和空白对照组进行成骨诱导21天,茜素红染色后倒置显微镜下(×100倍)观察并计数；8.转染组、空载体组和空白对照组细胞进行脂肪诱导14天,油红O染色后倒置显微镜下(×100倍)观察并计数。结果：1.成功设计筛选出四个特异性位点,并构建出重组表达载体shRNA NC, shRNA648, shRNA1344, shRNA1427, shRNA1815,扩增后提取质粒进行酶切鉴定显示质粒构建成功；2.Real-time PCR检测发现shRNA1344转染组的PPARy mRNA相对表达量与其他细胞转染组及空白对照组有统计学差异,shRNA1344是干扰率最高的表达载体；3.提取的脂肪干细胞呈梭型密集生长,贴壁良好；4.脂质体转染剂RNAi-mate介导质粒载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA1344成功转染第三代ADSCs,荧光显微镜下观察计算出其瞬时转染率为(15.4±1.48)%；5.经浓度400μg/ml G418筛选后获稳定转染的细胞,western-blot检测shRNA1344转染组的PPARy相对表达量为0.827±0.068,与空白组比较(p<0.01),差异有显著性；6.MTT法绘制细胞生长曲线表明,脂质体转染剂RNAi-mate介导目的基因转染,对于ADSCs的生长、增值无明显影响；7.转染组、空载体组和空白对照组进行成骨诱导21天,茜素红染色镜下成骨细胞计数,转染组相对空白对照组及空载体组有所增加(p<0.01),有统计学意义；8.转染组、空载体组和空白对照组进行成脂诱导14天后,油红O染色显微镜下脂肪细胞计数转染组相比空白对照组及空载体组明显减少(p<0.01),有统计学意义。结论：1. shRNA表达载体成功构建；2. shRNA1344成功转染并干扰沉默ADSCs的PPARy基因；3.转染的ADSCs细胞生长及增值无明显影响,通过G418筛选可获得ADSCs转染后的稳定细胞；4.RNA干扰沉默PPARy基因,兔ADSCs成脂能力下降,成骨能力提高。