目前,原位肝移植(Orthotopic liver transplantation,OLT)是治疗终末期肝病最有效和常规措施。然而,尽管由于外科技术的标准化、免疫抑制剂的不断研发和应用,移植物的长期存活率没有明显提高。器官移植术后的排斥反应仍是威胁患者和移植物长期存活的主要原因。免疫抑制剂的应用,不仅使器官移植成为终末期肾、肝、心脏疾病可接受的治疗方式,而且显著减少了急性排斥的发生率,同时显著提高了器官移植病人的短期、长期生存率。然而,免疫抑制剂的应用带来了许多问题。首先,要终身连续对免疫系统进行非特异性免疫抑制。第二,当前使用的免疫抑制剂中,没有一种能完全预防急性排斥或者慢性排斥。第三,免疫抑制剂的应用带来了肿瘤和感染的风险。第四,免疫抑制剂的应用增加了移植病人高血压的风险以及由此导致的心血管并发症。因此,诱导受者对供者器官特异性免疫耐受是解决排斥反应最理想的措施,相对免疫抑制疗法,诱导免疫耐受的优势是从根本上避免了排斥反应,又不影响机体的正常抗感染和免疫监视功能,同时避免了药物毒性。而且,耐受的诱导对于最终克服异种移植免疫学障碍也许是最佳途径,因为异种移植免疫抑制需长期高水平的、非特异性的免疫抑制剂来维持。因此,诱导移植免疫耐受性,控制移植物排斥反应,保护移植器官的功能,这无论在同种移植和异种移植中都是十分重要的课题。由于移植免疫耐受的机制十分复杂,尽管诱导免疫耐受的方法众多,但均未能达到完全可靠持久的特异性耐受。细胞凋亡是生物体内普遍存在的一种生理和病理现象,是正常器官和组织发育、清除有害的、过量的和无功能细胞、维持自身稳态的必要环节。现有研究表明:凋亡是机体免疫状态保持平衡和稳定的重要作用机制,凋亡细胞对免疫系统存在着主动的调节作用。凋亡细胞能分泌脂类趋化因子,改变自身胞膜结构表达“eat-me”信号,诱导吞噬细胞对其进行清除;同时凋亡细胞被抗原提呈细胞吞噬后,通过吞噬细胞分泌抑制性免疫因子如TGF-β、PGE2、IL-10等,造成了特殊的抗原识别微环境,可以促使相关淋巴细胞针对凋亡抗原产生免疫耐受,而不会引起炎性免疫应答。据此,孙尔维等提出利用供体凋亡细胞输注受体诱导供体特异性免疫耐受的理论设想。细胞因子是活化细胞产生的细胞间信号多肽。大多数细胞因子都有多种来源,多种作用靶位和多种功效。细胞因子网络是参与免疫识别、应答反应的重要成分,也是决定免疫反应发生方向的主要因素之一。抗原性物质进入机体后引起免疫系统发生的各种反应变化中包括了细胞因子比例水平的改变,由于后者直接参与前者的发生过程与最后结果表现,从而探讨细胞因子的变现表现对分析以及预测免疫反应发生和走向有一定的意义。我们课题组以前的工作证实,一定数量的供体凋亡脾淋巴细胞预输注可以诱导大鼠心、肝脏移植模型产生特异性免疫耐受,延长移植存活的时间。且通过对凋亡细胞进行示踪实验,发现凋亡的脾淋巴细胞主要聚集并驻留于肝脏,且对肝脏组织的细胞因子的微环境产生了影响。但输入的过程中是否也影响外周的细胞因子微环境,这对下部进一步探讨诱导凋亡的机制有重要的影响。所以本实验主要在前期的基础上,对供体凋亡脾淋巴细胞预输注是否影响外周血微环境进行研究。目的已知凋亡细胞发生免疫调节作用时也会同时伴有细胞因子等微环境的变化。且前期工作证明供体凋亡脾淋巴细胞输注对受体肝脏内细胞因子微环境有影响,本部分对供体凋亡细胞输注后对外周血免疫微环境中一系列重要细胞因子的变化进行观察,以了解供体凋亡脾淋巴细胞输注对外周血细胞因子的影响。方法供体C57BL小鼠14只,8-10周,雄性;受体Balb/c小鼠6-8周,50只,雄性。具体如下:(1)机械研磨法分离脾脏细胞,易得分离液分离淋巴细胞。(2)紫外线照射法诱导凋亡,流式细胞仪检测细胞凋亡率。(3)采用尾静脉输入法,每处理组每时间点5只小鼠,预输注处理分组:供体脾脏活细胞处理组(Liver cell treatment group,LG),供体脾脏凋亡细胞处理组(Apoptotic cell treatment group,AG);(4)检测时间点:输注后0h、1h、3h、6h、12h;(5)采用体外心脏采血法,收集样本;(6) Luminex技术液态芯片法检测外周血IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、GM-CSF(粒细胞-巨细胞激落刺激因子)、IFN-γ、TNF(肿瘤坏死因子);(7)所有实验数据利用SPSS13.0和GraphPad PRISM 3.02等软件进行统计学分析和作图。统计①两因素对各因子作用的分析比较,使用SPSS13.0软件之General LinearModel-Univatiate分析,两处理组各个点的比较,使用SPSS13.0软件之One-way ANOVE分析,方差不齐的,选用Independent Samples近似Test;②各个处理组中时间点于0h之间的比较,使用SPSS13.0软件之One-way ANOVE分析,方差不齐的,选用Independent Samples近似Test;③采用GraphPad PRISM 3.02软件进行制图。结果(1)流式细胞术分析,紫外线诱导的凋亡细胞的比例可达到41.07%以上。(2)活细胞组对外周细胞因子的影响(因IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、TNF在外周血液中的水平低于仪器的检测水平,未测出):外周血中IFN-γ在6h时细胞因子浓度明显升高(P=0.010,6h),IL-10于3h和6h时细胞因子浓度明显升高(P=0.009,3h;P=0.015,6h),IL-12、GM-CSF、IFN-γ在各个时间点无显著性差异。(3)凋亡细胞组对外周细胞因子的影响:IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ在各个时间点无明显的差异,GM-CSF在3h时明显升高(P=0.049)。(4)处理组不同对外周细胞因子微环境的影响:①IL-6:活细胞组和凋亡细胞组相比于1h时存在显著性差异(P=0.035,1h),活细胞组的水平高于凋亡细胞组。②IL-10:活细胞组和凋亡细胞组相比于分别于3h、6h、12时存在显著性差异(P=0.001,3h;P=0.001,6h;P=0.043,12h),活细胞组的水平高于凋亡细胞组。③IL-12、GM-CSF、IFN-γ在活细胞组和凋亡细胞组相比中无显著性差异。结论本实验证明凋亡细胞组和活细胞组相比,外周IL-6在1h时有显著性差异和IL-10在3h、6h和12h时存在显著性差异,活细胞组高于凋亡细胞组,其他细胞因子都无显著性差异,而且活细胞输注后,3h、6h的IL-10浓度明显高于0h。凋亡细胞输注后对细胞因子基本无改变,从IL-6和IL-10的结果我们可以推测:活细胞输注后,机体产生了急性炎性反应,使IL-6于1h时升高,而3小时后,机体为了避免炎性反应过度而采取了保护措施,增加IL-10的分泌,阻断了单核、巨噬细胞合成IL-6、TNFα等介质,而凋亡细胞对机体外周血无明显的作用,根据凋亡细胞是一种死细胞,具有完整的包膜,在组织中的清理主要为吞噬作用,可能相对于异种的活细胞引起的炎性反应作用较弱。凋亡细胞输入后,对外周血中GM-CFS浓度在3h时明显升高和活细胞输入后,6h时对外周血中IFN-γ浓度的影响有显著性意义,具体机制还需要进一步研究。而根据以往的研究,凋亡细胞对机体有明确的作用,可以引起免疫耐受的,而且本课题组的前期研究通过对凋亡细胞进行示踪实验,发现凋亡的脾淋巴细胞主要聚集并驻留于肝脏,且对肝脏组织的细胞因子的微环境产生了影响,包括IL-1β、IL-4、IL-10、和IFN-γ的特异性分泌水平提高,从而推测凋亡细胞主要在在肝脏起作用,对外周无明显的影响。但具体的机制还需要进一步对肝组织中其他细胞类型和反应功能的改变,如记忆T细胞、B细胞等进行相续的研究。