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[背景]
天疱疮是一组危重的累及皮肤、黏膜的自身免疫性疾病，主要由针对桥粒芯蛋白1和(或)3的自身抗体导致细胞间粘附丧失而引起发病，其最主要的临床类型为寻常型天疱疮和落叶型天疱疮，它们的变异型分别为增殖型天疱疮和红斑型天疱疮，此外还有一些更为少见的特殊类型。天疱疮皮损多为在外观正常的皮肤和(或)黏膜上出现松弛性水疱或大疱，尼氏征阳性。该病流行病学特征在不同的国家地区有显著差别，年发病率为0.76-6.7/百万人，绝大多数患者发病年龄在40-60岁之间，也有3岁儿童和102岁老人发病的报道。表观遗传调控是指在基因的DNA序列未发生改变的情况下，通过DNA甲基化修饰、组蛋白修饰、非编码RNA调控等方式来调控基因的表达，并可遗传给后代。其中DNA甲基化是最重要、研究最为深入的表观遗传调控之一，广泛参与各种生物学过程，主要过程是在甲基化酶的催化下，将S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将甲基转移至胞嘧啶的第五位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化在多种类型的疾病如自身免疫性疾病、肿瘤中发挥着重要作用。有研究表明寻常型天疱疮患者较健康人群DNA甲基化水平升高，但其升高程度、相关基因、具体原因、机制、表现及意义尚不完全清楚。
[目的]
整合天疱疮甲基化和转录组数据，筛选甲基化水平异常的位点，初步分析其所在基因在天疱疮发病中可能的作用。
[方法]
分别收集20例病理确诊为天疱疮的患者和21例正常健康人的外周静脉血，采用密度梯度离心法提取外周血单个核细胞，然后用QIAampDNAMinikit试剂盒提取其中的基因组DNA。样本质量检测合格后利用IlluminaInfiniumMethylationEPICBeadChip芯片技术对DNA进行全基因组甲基化检测。样本检测完成后去除污染、接头及低质量的数据，再通过与参考基因组比对，统计各个样本的DNA甲基化水平信息，分析甲基化检测数据，以满足“DeltaBeta值大于0.1或者小于-0.1”或满足“P值小于1*10-15”的条件进行初步筛选，发现异常位点和相应异常基因，并利用g:Profiler平台(http://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)等对这些基因进行富集分析。随后联合实验室已有的该20例天疱疮患者和21例正常对照的转录组测序数据与甲基化数据进行关联分析，以满足“甲基化测序数据与转录组测序数据趋势一致且呈显著相关，即corr值小于-0.4，且P值＜0.01”的条件进一步筛选出甲基化水平异常的候选基因，利用Wilcoxon秩和检验对这些基因所包含的异常甲基化位点进行寻常型天疱疮患者组和红斑型天疱疮患者组的组间差异比较。最后初步分析候选基因在天疱疮发病中所起的作用。
[结果]
通过IlluminaInfiniumMethylationEPICBeadChip芯片技术获得足够测序深度及分辨率的全基因组甲基化图谱，经过质量控制和筛选程序后，对356005个甲基化位点进行了差异分析。同正常对照外周血单个核细胞相比，天疱疮患者甲基化异常变化的CpG区域有5958个，其中甲基化水平升高的位点有4204个，甲基化水平降低的位点有1754个。在甲基化水平升高的4204个位点中，有20％的CpG位点位于启动子区域，46％的CpG位点位于body区域，而在甲基化水平降低的1754个位点中，有45％的CpG位点位于启动子区域，29％的CpG位点位于body区域。通过g:Profiler平台对有甲基化异常变化位点的基因进行GO分析，提示基因分子功能包括ATP结合、腺嘌呤核苷酸结合、细胞代谢、细胞应激，KEGG通路包括自噬-其他、人乳头瘤病毒感染等。联合转录组数据进行关联分析后，进一步筛选出甲基化水平与其基因表达呈显著负相关的56个CpG位点，其中甲基化程度上调位点39个，38％位于启动子区域，甲基化程度下调位点17个，65％位于启动子区域。同时，Wilcoxon秩和检验结果显示寻常型天疱疮患者组和红斑型天疱疮患者组之间的甲基化程度差异在该56个CpG位点并无统计学意义。该56个位点所对应的49个基因功能多样，如HLA-DQB1与天疱疮的易感性密切相关，HRG与坏死细胞的吞噬相关，GLUL，CCAR1，RBM5，ERC1，GALNT12，LIN28A等与肿瘤相关。
[结论]
天疱疮患者PBMC中具有大量的甲基化水平异常的位点，这些位点所在的基因功能多样且与该病发生、发展相关，信号通路复杂，筛选出的HLA-DQB1、HRG、GLUL、CCAR1、RBM5、ERC1、GALNT12、LIN28A等49个基因具体作用及分子机制需要后续进一步探究验证。
天疱疮是一组危重的累及皮肤、黏膜的自身免疫性疾病，主要由针对桥粒芯蛋白1和(或)3的自身抗体导致细胞间粘附丧失而引起发病，其最主要的临床类型为寻常型天疱疮和落叶型天疱疮，它们的变异型分别为增殖型天疱疮和红斑型天疱疮，此外还有一些更为少见的特殊类型。天疱疮皮损多为在外观正常的皮肤和(或)黏膜上出现松弛性水疱或大疱，尼氏征阳性。该病流行病学特征在不同的国家地区有显著差别，年发病率为0.76-6.7/百万人，绝大多数患者发病年龄在40-60岁之间，也有3岁儿童和102岁老人发病的报道。表观遗传调控是指在基因的DNA序列未发生改变的情况下，通过DNA甲基化修饰、组蛋白修饰、非编码RNA调控等方式来调控基因的表达，并可遗传给后代。其中DNA甲基化是最重要、研究最为深入的表观遗传调控之一，广泛参与各种生物学过程，主要过程是在甲基化酶的催化下，将S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将甲基转移至胞嘧啶的第五位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化在多种类型的疾病如自身免疫性疾病、肿瘤中发挥着重要作用。有研究表明寻常型天疱疮患者较健康人群DNA甲基化水平升高，但其升高程度、相关基因、具体原因、机制、表现及意义尚不完全清楚。
[目的]
整合天疱疮甲基化和转录组数据，筛选甲基化水平异常的位点，初步分析其所在基因在天疱疮发病中可能的作用。
[方法]
分别收集20例病理确诊为天疱疮的患者和21例正常健康人的外周静脉血，采用密度梯度离心法提取外周血单个核细胞，然后用QIAampDNAMinikit试剂盒提取其中的基因组DNA。样本质量检测合格后利用IlluminaInfiniumMethylationEPICBeadChip芯片技术对DNA进行全基因组甲基化检测。样本检测完成后去除污染、接头及低质量的数据，再通过与参考基因组比对，统计各个样本的DNA甲基化水平信息，分析甲基化检测数据，以满足“DeltaBeta值大于0.1或者小于-0.1”或满足“P值小于1*10-15”的条件进行初步筛选，发现异常位点和相应异常基因，并利用g:Profiler平台(http://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)等对这些基因进行富集分析。随后联合实验室已有的该20例天疱疮患者和21例正常对照的转录组测序数据与甲基化数据进行关联分析，以满足“甲基化测序数据与转录组测序数据趋势一致且呈显著相关，即corr值小于-0.4，且P值＜0.01”的条件进一步筛选出甲基化水平异常的候选基因，利用Wilcoxon秩和检验对这些基因所包含的异常甲基化位点进行寻常型天疱疮患者组和红斑型天疱疮患者组的组间差异比较。最后初步分析候选基因在天疱疮发病中所起的作用。
[结果]
通过IlluminaInfiniumMethylationEPICBeadChip芯片技术获得足够测序深度及分辨率的全基因组甲基化图谱，经过质量控制和筛选程序后，对356005个甲基化位点进行了差异分析。同正常对照外周血单个核细胞相比，天疱疮患者甲基化异常变化的CpG区域有5958个，其中甲基化水平升高的位点有4204个，甲基化水平降低的位点有1754个。在甲基化水平升高的4204个位点中，有20％的CpG位点位于启动子区域，46％的CpG位点位于body区域，而在甲基化水平降低的1754个位点中，有45％的CpG位点位于启动子区域，29％的CpG位点位于body区域。通过g:Profiler平台对有甲基化异常变化位点的基因进行GO分析，提示基因分子功能包括ATP结合、腺嘌呤核苷酸结合、细胞代谢、细胞应激，KEGG通路包括自噬-其他、人乳头瘤病毒感染等。联合转录组数据进行关联分析后，进一步筛选出甲基化水平与其基因表达呈显著负相关的56个CpG位点，其中甲基化程度上调位点39个，38％位于启动子区域，甲基化程度下调位点17个，65％位于启动子区域。同时，Wilcoxon秩和检验结果显示寻常型天疱疮患者组和红斑型天疱疮患者组之间的甲基化程度差异在该56个CpG位点并无统计学意义。该56个位点所对应的49个基因功能多样，如HLA-DQB1与天疱疮的易感性密切相关，HRG与坏死细胞的吞噬相关，GLUL，CCAR1，RBM5，ERC1，GALNT12，LIN28A等与肿瘤相关。
[结论]
天疱疮患者PBMC中具有大量的甲基化水平异常的位点，这些位点所在的基因功能多样且与该病发生、发展相关，信号通路复杂，筛选出的HLA-DQB1、HRG、GLUL、CCAR1、RBM5、ERC1、GALNT12、LIN28A等49个基因具体作用及分子机制需要后续进一步探究验证。