研究背景和目的宫颈癌是妇女生殖系统中最常见的恶性肿瘤。近年国外报道在普通人群中宫颈癌的发病率有所下降,但在发展中国家尤其在我国,由于HPV感染增多、筛查程序的混乱等,宫颈癌的发病率和死亡率反而增加并有年轻化倾向。虽然筛查和手术联合综合治疗的防治模式已有效改善早期宫颈癌的预后,但转移、复发的宫颈癌却很难达到彻底根治,也是患者死亡的主要危险因素。因而,加强宫颈癌侵袭进展机制的基础研究,阐明宫颈癌转移的分子机制,对宫颈癌转移进行早期预测、诊断和预后评估及对于提高宫颈癌治愈率,降低死亡率具有重要科学意义,文献报道人类癌症中存在miRNAs的异常表达,50%以上的人类miRNAs位于肿瘤相关基因区域,例如脆性位点、杂合子丢失区或靠近癌基因、抑癌基因的部位,易于发生缺失、扩增或转位等。因此,,miRNAs可能通过靶向调控特定的癌基因或抑癌基因而在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。同时,miRNAs还受上游转录因子的调控,这样从上到下构成复杂的调控网络进一步调节肿瘤的发生发展,miRNAs与宫颈癌关系的报道近年来逐渐增多,在宫颈癌侵袭转移的过程中具有重要作用。本文利用miRNA芯片在稳定细胞株中(siha-twist2及siha-shtwist2)筛选出与宫颈癌侵袭转移因子twist2密切相关的niRNA221,明确其在宫颈癌侵袭转移中的作用机制。本文的研究目的如下：1.宫颈癌侵袭转移相关miRNA的筛选及验证；2.miR221通过靶基因ARID1A及wnt/β-catenin信号通路在宫颈癌侵袭转移中的作用；3.miR221与上游转录因子twist2之间作用的鉴定。研究方法1.宫颈癌侵袭转移相关niRNA的筛选及功能验证1.1利用稳筛细胞株(siha-twist2及siha-shtwist2)及miRNA芯片筛选与宫颈癌侵袭转移因子twist2相关的miRNA并通过荧光定量PCR法(qPCR)验证芯片结果。1.2利用qPCR、westernblot、划痕实验及Borden侵袭小室实验对miRNA221在宫颈癌细胞侵袭转移行为中的作用进行验证。2. miR221通过靶基因ARID1A及wnt/p-catenin信号通路在宫颈癌侵袭转移中的作用2.1选取10个常用的miRNA靶基因预测软件DIANAmT、miRanda、miRDB、 miRWalk、RNAhybrid、PICTAR4、PICTAR5、PITA、RNA22、Targetscan对miRNA221的下游靶基因进行预测；利用NIAID/NIH提供的DAVID6.7分析平台并结合Biocarta pathway和KEGG pathway软件对miR-221的下游靶基因进行了功能聚类及信号通路分析。2.2利用westernblot、载体构建及双荧光素酶报告分析实验对miRNA221下游靶基因ARID1A及wnt/β-catenin信号通路的调控进行验证。3.miR221与上游转录因子twist2之间作用的鉴定3.1利用qPCR、westernblot、划痕实验及Borden侵袭小室实验对上游转录因子twist2调控niRNA221诱导宫颈癌细胞侵袭转移行为进行探讨。3.2利用载体构建及双荧光素酶报告分析实验对miRNA221与上游转录因子twist2之间直接作用进行验证。研究结果1.宫颈癌侵袭转移相关miRNA的筛选及功能验证1.1宫颈癌侵袭转移相关miRNA的筛选利用配对细胞株siha、siha-tw2、siha-shtw2送检芯片,结果提示8个差异性表达最明显的1nicroRNA,其中包括miRNA221;利用实时荧光定量PCR(qPCR)在配对细胞株中检测差异表达明显的microRNA,对芯片结果进行验证,2-△△CT值通过单因素方差分析结果显示：miRNA221差异性表达明显(F=64.64,P<0.001),进一步在宫颈癌组织中检测miRNA221的表达,发现宫颈癌组织中miRNA221的表达与twist2的表达呈正相关,与芯片结果相符(F0.70,F=24.75,P<0.001)。1.2miR221对宫颈癌细胞侵袭转移行为的影响(1)利用qPCR检测宫颈癌细胞株siha、siha-nc(m)、siha-nc(i)、siha-m、siha-i中miR221及EMT相关标记物(E-CAD、N-CAD、Vimentin)的表达,以siha组为对照,经单因素方差分析检测,结果显示五组间E-CAD、N-CAD、Vimentin的表达具有显著差异(F=34.1,P<0.001;F=27.026,P<0.001;F=17,P<0.001);对5组间进行两两比较,结果显示,miR-221在siha-m中的表达明显高于siha及siha-nc(m)组,且EMT相关标记物E-CAD表达明显降低,而N-CAD及Vimentin表达明显上升；miR-221在siha-i中的表达明显低于siha及siha-nc(i)组,EMT相关标记物E-CAD表达明显升高,而N-CAD及Vimentin表达明显下降。(2)利用westemblot检测宫颈癌细胞株siha、siha-nc(m)、siha-nc(i)、siha-m、 siha-i中EMT相关标记物(E-CAD、N-CAD、Vimentin)的表达,结果显示,在宫颈癌siha细胞中,E-CAD在过表达niR221组siha-m中的表达明显低于siha及siha-nc(m),而N-CAD及Vimentin的表达明显增高；相反,E-CAD在沉默miR-221组siha-i的表达明显增高,而N-CAD及Vimentin的表达明显降低。(3)利用划痕实验检测宫颈癌细胞株siha、siha-nc(m)、siha-nc(i)、siha-m、 siha-i不同组中宫颈癌细胞的迁移能力,结果显示,siha-m组的细胞迁移能力明显高于siha、siha-nc(m)组,而siha-i组的细胞迁移能力明显低于siha、siha-nc(i)。(4)利用Borden侵袭小室检测宫颈癌细胞株siha、siha-nc(m)、siha-nc(i)、 siha-m、siha-i不同组之间细胞的体外侵袭能力变化,统计结果显示,5组之间细胞的侵袭能力具有显著性差异。且siha-m组细胞穿膜数目比siha、siha-nc(m)显著增多,而siha-i组细胞穿膜数目比siha、siha-nc(i)显著减少。2.miR221通过靶基因ARID1A及wnt/β-catenin信号通路在宫颈癌侵袭转移中的作用2.1miR221下游靶基因及信号通路的预测(1)miR221下游靶基因的生物信息学预测选取10个常用的niRNA靶基因预测软件DIANAmT、miRanda、miRDB、 miRWalk、RNAhybrid、PICTAR4、PICTAR5、PITA、RNA22、Targetscan对miR-221的靶基因进行预测,ARID1A基因的预测值最高,于是我们选择ARID1A作为miR-221的靶基因。并对靶基因ARID1A进行实验鉴定。(2)MiR221下游信号通路的生物信息学预测利用NIAID/NIH提供的DAVID6.7分析平台并结合Biocarta pathway和KEGG pathway软件对miR-221的下游靶基因进行了功能聚类及信号通路分析,结果显示wnt/β-catenin信号通路的预测频率最高。2.2miR221对下游靶基因ARID1A及wnt/β-catenin信号通路的调控(1)利用westernblot检测宫颈癌细胞株siha不同处理组siha、siha-nc(m)、 siha-nc(i)、siha-m、siha-i中ARID1A及磷酸化β-catenin的表达情况,结果显示,siha-m组中ARID1A的表达明显低于siha及siha-nc(m)组；而siha-i组中ARID1A的表达明显高于siha及siha-nc(i)组；siha-m组中磷酸化β-catenin的表达明显低于siha及siha-nc(m)组,而siha-i组与siha、siha-nc(i)组之间磷酸化P-catenin的表达无明显差异。(2)在宫颈癌细胞株siha中,转染构建质粒pscicheck2/ARID1A及miR221mimic,对siha(blank)、miR221NC-lu、miR221mi-luc三组利用双荧光素酶报告分析方法检测各组细胞中荧光素酶活性,结果显示,同时转染了pscicheck2/ARID1A及miR221mimic的miR221mi-luc组的荧光素酶活性明显低于blan、miR221NC-luc组(=635.4,P<0.001),blank及miR221NC-luc组之间无统计学差异。3.miR221与上游转录因子twist2之间作用的鉴定3.1twist2对miR221促进宫颈癌侵袭转移行为的调控(1)利用qPCR检测宫颈癌细胞株siha、sihatw2、sihashtw2、sihatw2i、 sihashtw2-m中EMT相关标记物(E-CAD、N-CAD、Vimentin)的表达,以siha组为对照,经单因素方差分析检测,结果显示五组间E-CAD、N-CAD、Vimentin的表达具有显著差异(F=221.991,P<0.001;F=369.073,P<0.001;F=404.261,P<0.001)；对5组间进行两两比较,结果显示,E-CAD在sihatw2-i(转染了miR221inhibitor)中的表达明显高于sihatw2组,而N-CAD及Vimentin表达明显下降；E-CAD在sihashtw2-m(转染了miR221mimic)中的表达明显低于sihashtw2组,而N-CAD及Vimentin表达明显上升。(2)利用westernblot检测宫颈癌细胞株siha、sihatw2、sihashtw2、sihatw2-i、 sihashtw2-m中EMT相关标记物(E-CAD、N-CAD、Vimentin)的表达,结果提示：E-CAD在过表达miR221组sihashtw2-m中的表达明显低于sihashtw2,而N-CAD及Vimentin的表达明显增高；相反,E-CAD在沉默miR-221组sihatw2-i的表达较siha及sihatw2明显增高,而N-CAD及Vimentin的表达明显降低。(3)利用划痕实验检测宫颈癌细胞株siha、sihatw2、sihashtw2、sihatw2-i、sihashtw2-m不同组中宫颈癌细胞的迁移能力,结果显示,sihashtw2-m组的细胞迁移能力明显高于sihashtw2组,而sihatw2-i组的细胞迁移能力明显低于sihatw2。(4)利用Borden侵袭小室检测宫颈癌细胞株siha、sihatw2、sihashtw2、sihatw2-i、 sihashtw2-m不同组之间细胞的体外侵袭能力变化,统计结果显示,5组之间细胞的侵袭能力具有显著性差异。且sihashtw2-m组细胞穿膜数目比sihashtw2显著增多,而sihatw2-i组细胞穿膜数目比sihatw2显著减少。3.2twist2与miR221直接作用的验证(1)通过Ensembl数据库,在线获得编码miR221序列上游2kb作为miR-221的启动子序列。(2)利用三种在线软件(Mapper2,Consite及TRED)预测及分析可能与miR-221启动子结合的转录因子,并结合前期关于宫颈癌侵袭转移的相关研究,确定twist2作为miR-221的转录因子。(3)利用双荧光素酶报告基因检测miR221启动子和转录因子twist2之间的荧光素酶活性,结果显示,当共同转染PGL3-basic/221和pcDNA3.1/tw2时,共同转染组(tw2+PGL3-221)较单独转染PGL3-221组及blank组荧光素酶活性显著增强,表明twist2能明显促进miR-221启动子的转录活性(F=130,P<0.001)。结论1、成功筛选出与宫颈癌侵袭转移因子twist2相关的8个miRNA,通过在细胞株siha、siha-tw2、siha-shtw2中验证得出miR221、miR221*、miR502-3p的差异性表达与芯片结果相符,其中,miR221差异性表达最明显。2、miR-221可能通过靶基因ARID1A及wnt/β-catenin信号通路促进宫颈癌细胞的侵袭转移。3、twist2正性调控miR221的表达,促进其在宫颈癌侵袭转移中的作用。4、提出一个新的调控机制,即miR-221在twist2转录因子的正性调控下可能通过ARID1A及wnt/β-catenin信号通路促进宫颈癌的侵袭和转移。本项目的创新之处1、已发现miR221在多种肿瘤发生发展中起促进作用,而其与宫颈癌侵袭转移的关系尚未见报道。2、提出了一个新的miR221表达调控机制,选题具有很好的原始创新性和鲜明的研究特色。3、阐明twist2/miR221/ARID1A在宫颈癌侵袭和转移中的作用机制,将为肿瘤转移的诊治、预后及药物筛选提供新的基因和miRNA靶点。