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第一部分:糖尿病心肌病大鼠模型的建立[目的]探讨糖尿病心肌病(Diabetes cardiomyopathy,DCM)大鼠模型形成的时间。[方法](1)将35只雄性SD大鼠随机分为正常对照组(n=5)、糖尿病(Diabetes mellitus,DM)组(n=30 只),使用链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)60mg/Kg 一次性腹腔注射建立糖尿病大鼠模型;然后再将糖尿病组大鼠随机分为糖尿病4周组(n=10只)、糖尿病8周组(n=10只)、糖尿病12周组(n=10只)。观察大鼠体重、皮毛、活动及饮水情况变化,每周测量各大鼠的血糖及体重。(2)超声检查测量各组大鼠的心功能,超声测量参数包括左室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室短轴缩短率(Left ventricular fractional shortening,LVFS)、左心室舒张末期内径(Left ventricular end-diastolic dimension,LVDd)、左心室收缩末期内径(Left ventricular end-systolic dimension,LVDs)。(3)左心室心肌组织HE染色、电镜检查,观察各组大鼠心肌细胞形态学变化;(4)末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测各组大鼠的心肌细胞凋亡情况;(5)实时荧光定量PCR检测Bcl-2、Bax的mRNA的相对表达量;(6)蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测caspase-3蛋白的相对表达量。[结果](1)与正常对照组相比,糖尿病4周组、糖尿病8周组及糖尿病12周组的大鼠的血糖值均明显升高(p<0.05),体重均低于正常对照组(p<0.05)。糖尿病12周组大鼠的平均体重高于糖尿病4周组和糖尿病8周组(p<0.05)。(2)与正常对照组相比,糖尿病4周组、糖尿病8周组、糖尿病12周组的大鼠的心功能均明显下降(p<0.01),且随着糖尿病形成时间的延长,心功能进一步下降。(3)HE染色显示对照组大鼠的心肌细胞排列整齐,无心肌细胞变性水肿,而糖尿病4周组、糖尿病8周组、糖尿病12周组心肌组织结构十分紊乱,随着糖尿病形成时间的延长,这种形态改变更为严重。(4)透射电镜观察可见对照组心肌细胞排列整齐,各条带清晰可见,细胞核无皱缩、破裂,线粒体呈椭圆形,线粒体嵴完整无断裂,无空泡化;糖尿病4周组、糖尿病8周组、糖尿病12周组大鼠的心肌组织可见心肌细胞排列紊乱,细胞核变形、破坏,线粒体变形,可见线粒体嵴空泡化、断裂。(5)TUNEL检测:对照组心肌组织的心肌细胞凋亡指数(ApoptoticIndex,AI;%)=(1.72±0.74)%,糖尿病 4 周组 AI=(32.81±2.80)%,较对照组明显增加,差异有统计学意义(p<0.001),糖尿病8周组AI=(47.27±8.03)%,与糖尿病4周组比较,差异有统计学意义(p<0.001),糖尿病12周组AI=(68.52 ± 8.69)%,比糖尿病8周组明显升高,差异有统计学意义(p<0.001)。(6)实时荧光定量PCR:与对照组比较,糖尿病4周组、糖尿病8周组和糖尿病12周组的Bcl-2的mRNA水平显著降低(p<0.05),随着糖尿病形成时间的延长,Bcl-2的mRNA进一步降低。与对照组相比,糖尿病4周组、糖尿病8周组、糖尿病12周组Bax的mRNA表达差异无统计学意义(p>0.05)。(7)Western blot结果:与对照组比较,糖尿病4周组、糖尿病8周组、糖尿病12周组的caspase-3蛋白水平明显升高,差异均具有统计学意义(p<0.05)。[结论]一次性链脲佐菌素腹腔注射可以成功制备稳定的糖尿病心肌病大鼠模型。第二部分:EPO通过抗心肌细胞凋亡保护糖尿病心肌病大鼠心功能[目的]探讨重组人促红细胞生成素(Recombinant human erythropoietin,rhEPO)对糖尿病心肌病大鼠心肌的保护作用及机制。并对糖尿病心肌病未来的治疗方法提出可行的理论依据。[方法](1)将25只大鼠随机分为3组:正常对照组(n=5)、糖尿病心肌病组(n=10只)、糖尿病心肌病+EPO治疗组(n=10只),按照第一部分的方法制备糖尿病心肌病大鼠模型,糖尿心肌病+EPO组给予rhEPO 2000U/kg腹腔注射,每周一次,共8周,每周测量大鼠血糖及体重。(2)超声检查、HE染色、电镜检查、TUNEL检查、Western blot及PCR检查同第一部分。[结果](1)与正常对照组相比,糖尿病心肌病组及糖尿病心肌病+EPO组大鼠的血糖值明显升高(p<0.05)、体重明显下降(p<0.05)。与糖尿病心肌病组相比,糖尿病心肌病+EPO组大鼠的血糖及体重差异无统计学意义(p>0.05)。(2)和正常对照组相比,糖尿病心肌病组及糖尿病心肌病+EPO组大鼠心功能下降,差异有统计学意义(p<0.05),与糖尿病心肌病组相比,糖尿病心肌病+EPO组大鼠心功能有改善,差异有统计学意义(p<0.05)。(3)HE染色显示对照组大鼠的心肌细胞排列整齐;糖尿病心肌病组大鼠的心肌细胞排列紊乱,大量心肌细胞变性、水肿、炎性细胞浸润;而糖尿病心肌病+EPO组大鼠心肌细胞形态较糖尿病心肌病组明显改善。(4)透射电镜观察可见对照组心肌细胞排列整齐,肌丝排列整齐,各条带清晰可见,细胞核无皱缩、破裂,线粒体呈线状排列,结构完整;糖尿病心肌病组心肌细胞排列紊乱,细胞核皱缩,线粒体排列紊乱,线粒体嵴明显空泡化、断裂;糖尿病心肌病+EPO组心肌细胞排列较糖尿病心肌病组明显改善。(5)TUNEL染色结果:对照组心肌细胞细胞凋亡指数AI=(1.72±0.74)%,糖尿病心肌病组AI=(68.52±8.69)%,较对照组明显增加,差异有统计学意义(p<0.001),糖尿病心肌病+EPO组AI=(37.20±11.16)%,较对照组增加(p<0.001),但较糖尿病心肌病组明显降低(p<0.001)。(6)实时荧光定量PCR:与对照组比较,糖尿病心肌病组及糖尿病心肌病+EPO组心肌组织的Bcl-2的mRNA的表达量明显降低,差异均有统计学意义(p<0.05),与糖尿病心肌病组比较,糖尿病心肌病+EPO组的Bcl-2的mRNA表达量明显增加,差异有统计学意义(p<0.05)。与对照组比较,糖尿病心肌病组心肌组织的Bax的mRNA的表达量轻度升高,但差异无统计学意义(p=0.273);与对照组及糖尿病心肌病组相比较,糖尿病心肌病+EPO组的Bax的mRNA相对表达量降低,差异均有统计学意义(p<0.05)。(7)Western blot结果:糖尿病心肌病组大鼠心肌组织的caspase-3的蛋白表达量较正常组增加(p<0.05),而EPO治疗可以降低升高的caspase-3水平(p<0.05)。[结论](1)EPO可以保护糖尿病心肌病大鼠的心功能;(2)EPO通过抑制心肌细胞凋亡保护糖尿病心肌病大鼠的心功能。