[研究背景和立题依据]新突发传染病(Emerging Infectious Diseases)已严重影响社会稳定、对人类健康构成重大威胁。目前对于新突发传染病的防治工作已成为传染病学研究的重点。针对目前大多数病原无特效药物的情况,疫苗的研发和储备已防控新突发传染病的重点和热点,并具有重大的社会意义。本课题应用两种不同的生物反应器对几种不同的病毒(疫苗候选株)进行大规模培养,优化培养的培养条件、理化参数,并进行质量控制以及不同佐剂的筛选评价研究。[研究目的]1.生物反应器大规模培养HEK293、Vero和MDCK细胞,监测糖代谢。2.在细胞培养基础上,大规模扩增腺病毒载体,肠道病毒71型/柯萨奇病毒16型(EV71/CVA16)以及流感病毒H1N1型,并优化培养参数和过程工艺。3.以生物反应器扩增病毒产物为基础,进行腺病毒载体的质量控制研究。4.对生物反应器病毒产物EV71/CVA16灭活处理,制备二价灭活疫苗,并进行免疫策略以及不同佐剂免疫效果的评价。[研究方法]1.用聚纤维纸片载体利用生物反应器扩增人胚肾细胞HEK293,建立腺病毒复制扩增的工艺流程,对5型腺病毒复制扩增体系全面适应的条件下,在细胞培养阶段用含10%的胎牛血清的DMEM培养基,培养细胞6天后换液成无血清培养基,吸附腺病毒2.5-3.5小时,加入3-5%胎牛血清,继续培养24小时,弃去全部培养液,并用磷酸缓冲液PBS冲洗去除血清,全部换成无血清培养基加0.25%水解乳蛋白,静止再吸附1.5-2.5小时以利于病毒再感染正常细胞,同时每20小时补充2g/L的葡萄糖,采用批式收获换液的方式收获病毒。2.5L反应器内已加入灭菌后的150g Fibra disk载体,用PH7.2的磷酸盐缓冲液PBS浸泡过夜,弃去后加入细胞生长液4L为一个工作体积,接种VERO细胞,接种量为2.3×109个细胞,进行培养。培养参数设定为:PH7.2-7.6、温度37℃、溶氧50-80%、搅拌速度50rpm。每天定时取样测定葡萄糖消耗情况,从而估计细胞生长情况,在稳定条件下,葡萄糖消耗与细胞密度线性相关。换液模式采用连续灌流,24-48小时灌注换液3L,48-72小时灌注换液3L,72-96小时灌注换液4L,96-120小时灌注换液3L,120-144小时灌注换液5L144小时细胞计数在(3.2±0.3)×1010个细胞,密度达到8×106个/ml以上。144小时换液4L,在无血清条件下吸附病毒(EV71/CVA16)3小时,然后加入5%的胎牛血清,继续培养22小时,换液成无血清培养基加0.5%水解乳蛋白,静止再吸附2小时,继续培养。接毒后收获方式采用连续收获,从接毒后24小时开始连续灌注,每24小时灌注收获5L,至120小时共收获上清20L上清用于浓缩、纯化:用膜包浓缩20-50倍,用于进一步纯化。3.用聚纤维纸片(Fibra disk)载体和生物反应器系统扩增犬肾上皮细胞(MDCK)从而建立流感病毒复制扩增的整套工艺流程。本发明建立在对H1N1型流感病毒复制扩增体系全面适应的条件下,在细胞培养阶段用含10%的血清的DMEM培养基,在病毒接种吸附后至24小时使用带5%的血清DMEM培养基加0.5%的胰酶,在收获病毒阶段采用无血清培养基添加0.25%的水解乳蛋白和0.25%的胰酶,同时每24小时补充1.5g/L的葡萄糖,采用批式收获换液方法收获病毒。4.在CVA16灭活疫苗基础上研究不同佐剂(氢氧化铝、MF59、海藻糖以及多肽水凝胶D-NPX、L-NPX)对小鼠体液免疫的作用。每隔2周免疫一次小鼠,二次免疫后14天尾静脉取血测中和抗体,计算几何平均值。[结果]1.建立了以纸片载体为基础的腺病毒大规模培养系统,在优化的工艺和培养策略下,单批次病毒可达到1.2×1015vp。2.建立了以纸片载体为基础的EV71/CVA16大规模培养系统,在优化的工艺和培养策略下,单批次病毒可分别达到1.2×108和8×107TCID50/mL。3.建立了以纸片载体为基础的流感病毒H1N1大规模培养系统,在优化的工艺和培养策略下,单批次病毒可达到和7.8×107TCID50/mL。4.佐剂MF59对CVA16型灭活疫苗的免疫增强的效果与氢氧化铝相近,高浓度海藻糖有一定的佐剂作用,而多肽水凝胶的佐剂作用更强,[结论]在最佳策略下大规模培养的腺病毒、EV71/CVA16及流感病毒H1N1质量较高,符合临床级开发产品要求,可用于中试和临床试验,并具有经济、高效、短周期的特点。不同佐剂(氢氧化铝、MF59和海藻糖以及多肽水凝胶D-NPX、L-NPX)对CVA16型灭活疫苗均有一定的佐剂作用。MF59在免疫增强的效果与氢氧化铝相近,海藻糖有一定的佐剂效果而需要进一步研究,而多肽水凝胶的佐剂作用更强,需要进一步的全面研究评价。