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相关研究结果表明,糖尿病是多遗传基因、生活方式、环境因素、免疫缺陷等因素引起的一种综合症,特点是慢性高血糖,伴随因胰岛素分泌及/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。但是,到目前为止,糖尿病病因和发病机制尚未完全阐明。代谢组学作为一门新兴学科,在疾病诊断与治疗、药物的药效和毒性评价、基因功能等领域具有独特的优势。本论文利用气相色谱-质谱(GC/MS)联用仪,选择有效的前处理方法、结合化学计量学中的多元分辨技术和模式识别方法,对健康小鼠、2型糖尿病小鼠(T2DM)、AMPKα2基因敲除小鼠的血清代谢谱进行了全面、细致的代谢组学研究。
一、建立了气相色谱-质谱法同时测定乳酸、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖、半乳糖、乳糖、1,5-脱水山梨醇、山梨醇的方法。选择核糖醇为内标,进样前先进行肟化反应再进行硅烷化反应。采用DB-5熔融石英毛细管柱,升温程序为初始温度70℃,保持4min,以8℃/min的速率升至300℃,保持3min。在该测定条件下各对照品得到良好分离,在测定范围内具有良好线性关系(r2>0.9983),平均加样回收率为74.5%~104.2%,日间RSD与日内RSD小于9.2%。本方法简便、灵敏度高,已成功应用于2型糖尿病大鼠和健康大鼠血清中乳酸和糖类物质的定性定量分析。
二、建立了小鼠血清代谢谱的气相色谱-质谱法分析方法,并对选择的分析条件进行了精密度、日内偏差、日间偏差和样品稳定性等方法学考察。利用NIST05质谱数据库对检测到得内源性代谢物进行快速定性分析,对于代谢谱图中存在的严重重叠色谱峰,我们借助了选择性离子分析法(SIA)进行分辨和解析,提高定性的准确性。在小鼠血清GC/MS代谢物谱中共定性相似度在80以上的内源性代谢物有48种。
三、应用所建立的方法对C57BL/6J健康雄性小鼠、KK-ay糖尿病雄性小鼠、腺苷酸活化蛋白激酶α2(AMPKα2)敲除雄性小鼠和AMPKα2敲除雌性小鼠血清代谢物进行了准确的定量分析,并运用主成分分析法(PCA)、竞争性自适应的重加权采样-偏最小二乘-线性判别分析(CARS-PLS-LDA)等化学计量学的方法成功的建立了健康组各周龄间、糖尿病病组各周龄间、健康组与糖尿病组间、健康组与AMPKα2敲除组间、AMPKα2敲除组性别间的判别模型,并筛选出与2型糖尿病、AMPKα2活性相关的重要的变量。旨在为2型糖尿病的临床诊断和治疗效果的评价、AMPKα2调节机制提供有用的信息。