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近几年来,基因组计划的完成为生命科学研究提供了广阔的平台,但是,生命的复杂性和多样性表明,仅对遗传信息载体——基因组进行研究,还远不能对生命活动的机理做出全面的解释。因此,要对复杂的生命活动有全面的认识,必然要在蛋白质水平上对生物体进行深入的研究。本文利用蛋白质组学方法,以牛精子为研究对象,对精子蛋白的制备方法,双向凝胶电泳等电聚焦程序、胶内蛋白酶切条件进行了优化,建立了高质量的蛋白质组学研究平台。通过双向凝胶电泳结合质谱技术分离和鉴定了牛X、Y精子的差异表达蛋白,并分析了蛋白功能。为X、Y精子细胞存在表达差异蛋白提供了直接依据,并为进一步免疫法分离X、Y精子奠定基础;同时,还为性别形成的分子机制的研究提供了一种新方法和新思路。采集奶牛冷冻精液和性控精液后,通过热TRIzol法裂解精子细胞,制备蛋白样品,经双向电泳后获得牛精子蛋白质图谱。通过ImageMasterTM 2D Platinum version 6.0图像分析软件检测牛X、Y精子差异表达的蛋白点,选择差异表达的蛋白点切割分离、胰蛋白酶胶内酶切消化后,将得到的酶切肽段通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）分析获得质谱峰图,再利用MASCOT软件搜索NCBInr、MSDB和SwissPort数据库进行匹配、比较,推测可能的蛋白质。实验结果:通过比较分析了不同的等电聚焦程序,最终确定了延长预聚焦过程的时间,获得了较好的蛋白图谱;比较不同的染色方法来改进染色与质谱鉴定的兼容性,发现银染的分辨率要好于Sweet silver方法;通过胶内酶切条件的优化,建立了稳定的使用于银染的胶内酶切程序,并从冷冻精液中鉴定出了16个蛋白点;从性控精子蛋白图谱比较后发现17个蛋白点存在差异,其中11个蛋白点在X精子表达上调,6个蛋白点在Y精子中表达下调。经酶切质谱鉴定和生物信息学分析出其中的12个差异蛋白点,其中热休克蛋白70 kDa、锌指蛋白394等在X精子中表达量上调,蛋白磷酸酶E1、瞬时受体电位通道7、半肌动蛋白、维生素K依赖蛋白等在Y精子中表达量上调,并且这些差异蛋白可能与精子生成和代谢有关。