论文部分内容阅读
色氨酸（Trp）是仔猪的必需氨基酸,可改善动物生长性能和肠道健康,但色氨酸对断奶仔猪肠道损伤修复的机理尚不清楚,有待进一步研究。本研究从体内和体外考察色氨酸对断奶仔猪肠道屏障损伤修复的影响和机理,包括下面三个试验:试验一不同水平色氨酸对断奶仔猪生长性能及肠道屏障损伤修复的影响选取24头体重相近（8.64±1.00 kg）的DLY断奶仔猪,根据体重一致原则随机分成4组:对照组、脂多糖（LPS）组、0.2%色氨酸+LPS组和0.4%色氨酸+LPS组。每组6个重复,每个重复1头猪,试验期35 d。除对照组仔猪在第35 d腹腔注射灭菌生理盐水,其余组仔猪在第35 d注射100μg/kg体重（BW）的LPS,所有仔猪于注射4 h后进行屠宰取样。结果如下:（1）生长性能:与对照组相比,0.2%色氨酸显著增加断奶仔猪平均日增重和平均日采食量,0.4%色氨酸显著增加断奶仔猪平均日采食量（P＜0.05）。（2）与LPS组相比,0.2%色氨酸+LPS及0.4%色氨酸+LPS显著减少血清中D-乳酸、二胺氧化酶（DAO）和内毒素含量（P＜0.05）。（3）血清和肠道促炎性细胞因子:与LPS组相比,0.2%色氨酸+LPS组及0.4%色氨酸+LPS组显著减少血清白介素1β（IL-1β）、IL-6和IL-8的含量以及显著减少空肠和回肠TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的m RNA表达水平及含量（P＜0.05）。（4）血清及肠道抗氧化:与LPS组相比,0.2%色氨酸+LPS及0.4%色氨酸+LPS显著提高血清、空肠和回肠中过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和总超氧化物歧化酶的活性（P＜0.05）,显著降低丙二醛、活性氧和过氧化氢的含量（P＜0.05）。（5）肠道形态学及消化酶活力:与LPS组相比,0.2%色氨酸+LPS及0.4%色氨酸+LPS组显著提高空肠及回肠绒毛高度、绒毛面积、绒毛高度与隐窝深度比、蔗糖酶和麦芽糖酶活力,显著降低空肠隐窝深度（P＜0.05）。（6）肠道紧密连接蛋白:与LPS组相比,0.2%色氨酸+LPS及0.4%色氨酸+LPS组显著提高空肠和回肠带状闭合蛋白-1（ZO-1）、claudin-1和occludin的m RNA表达水平（P＜0.05）。（7）结肠微生物和短链脂肪酸:与LPS组相比,0.2%色氨酸+LPS组显著增加结肠厌氧菌属、棒状杆菌属和unclassfied＿c＿Bacteroidia的相对丰度和丁酸、丙酸和异戊酸的含量（P＜0.05）。（8）肠道Ca2+含量和信号通路相关指标的m RNA表达及蛋白浓度:与LPS组相比,0.2%色氨酸+LPS以及0.4%色氨酸+LPS组显著提高空肠及回肠Ca2+、钙敏感受体（CaSR）、Ras相关的C3肉毒素底物1（Rac1）和磷脂酶Cγ1（PLC-γ1）的m RNA表达水平以及CaSR和PLC-γ1-Try783磷酸化的蛋白浓度（P＜0.05）。（9）血清色氨酸含量:与LPS组相比,0.2%色氨酸+LPS以及0.4%色氨酸+LPS组显著增加血清色氨酸含量（P＜0.05）。上述研究结果表明色氨酸能提高仔猪生长性能和调控肠道微生物结构,缓解仔猪肠道炎症反应,增强肠道抗氧化状态,保持肠道屏障的完整性促进仔猪肠道损伤修复。这种作用与CaSR/Rac1/PLC-γ1信号途径有关。试验二色氨酸对猪肠上皮细胞增殖和细胞迁移的影响本研究构建划痕损伤模型探究色氨酸对IPEC-J2细胞迁移的影响。结果表明:（1）0.3 mmol/L及0.7 mmol/L色氨酸显著促进IPEC-J2细胞增殖和细胞迁移（P＜0.05）。（2）与色氨酸组相比,NPS2143（CaSR抑制剂）+色氨酸显著降低细胞迁移和CaSR、GTP-rac1、总Rac1和PLC-γ1-Try783磷酸化的蛋白浓度,表明下调CaSR减少IPEC-J2细胞迁移（P＜0.05）。（3）与色氨酸组相比,过表达CaSR+色氨酸显著增加细胞迁移,显著增加GTP-rac1、总Rac1和PLC-γ1-Try783磷酸化的蛋白浓度（P＜0.05）,表明:上调CaSR促进IPEC-J2细胞迁移。（4）与对照组相比,色氨酸能显著促进IPEC-J2细胞迁移、CaSR、GTP-rac1、总Rac1PLC-γ1-Try783磷酸化的蛋白浓度（P＜0.05）。干扰Rac1和PLC-γ1后,色氨酸对IPEC-J2细胞迁移的促进作用被显著抑制;干扰Rac1后,色氨酸对GTP-rac1、总Rac1蛋白浓度的促进作用被显著抑制。干扰PLC-γ1后,色氨酸对PLC-γ1-Try783磷酸化的蛋白浓度的促进作用被显著抑制,表明:色氨酸通过激活Rac1/PLC-γ1信号促进细胞迁移（P＜0.05）。（5）与对照组相比,过表达CaSR显著增加IPEC-J2细胞迁移,显著增加GTP-rac1、总Rac1和PLC-γ1-Try783磷酸化的蛋白浓度（P＜0.05）。干扰Rac1和PLC-γ1后,过表达CaSR对IPEC-J2细胞迁移的促进作用被显著抑制。干扰Rac1后,过表达CaSR对GTP-rac1、总Rac1蛋白浓度的促进作用被显著抑制。干扰PLC-γ1后,过表达CaSR对PLC-γ1-Try783磷酸化的蛋白浓度的促进作用被显著抑制（P＜0.05）。以上结果表明:外源色氨酸能促进IPEC-J2细胞增殖,并通过CaSR/Rac1/PLC-γ1信号途径促进细胞迁移。试验三色氨酸对猪肠上皮细胞屏障损伤修复的影响本试验构建ETEC K88损伤模型,探讨色氨酸对猪肠上皮屏障功能的影响。结果如下:（1）与ETEC K88组相比,ETEC K88+色氨酸显著提高细胞跨上皮电阻（TEER）,降低异硫氰酸荧光素蔔聚糖4k Da（FD4）通透率（P＜0.05）,增加ZO-1、claudin-1、occludin、CaSR、GTP-rac1、总Rac1和PLC-γ1-Try783磷酸化的蛋白浓度,增加三磷酸肌醇的含量,降低细胞IL-8和TNF-α含量（P＜0.05）,表明:色氨酸能促进细胞紧密连接蛋白表达,提高肠上皮屏障功能,降低炎症。（2）与ETEC K88+色氨酸组相比,ETEC K88+色氨酸+NPS2143显著降低细胞TEER,提高FD4通透率,降低ZO-1、claudin-1、occludin、CaSR、GTP-rac1、总Rac1和PLC-γ1-Try783磷酸化的蛋白浓度,降低三磷酸肌醇的含量,增加IL-8和TNF-α含量（P＜0.05）,表明:色氨酸能通过CaSR信号通路提高肠上皮屏障功能、降低炎症,提高紧密连接蛋白表达完整性。（3）与ETEC K88+色氨酸组相比,ETEC K88+色氨酸+Rac1-si RNA和ETEC K88+色氨酸+PLC-γ1-si RNA显著降低细胞TEER,提高FD4通透率,增加IL-8和TNF-α含量（P＜0.05）,表明:色氨酸能通过Rac1/PLC-γ1信号通路促进IPEC-J2细胞屏障功能,降低通透性。（4）与对照组相比,过表达CaSR显著提高细胞TEER,降低FD4通透率（P＜0.05）。干扰Rac1和PLC-γ1后,细胞TEER显著下降,FD4通透率显著增加（P＜0.05）,表明:CaSR通过Rac1/PLC-γ1信号通路提高肠上皮屏障功能。上述结果表明:色氨酸能通过CaSR/Rac1/PLC-γ1信号途径提高肠上皮屏障完整性,降低炎性因子表达。综上所述,色氨酸能提高断奶仔猪生长性能和调控肠道微生物结构。色氨酸能提高断奶仔猪肠道抗氧化状态、降低肠道炎症、维护肠上皮屏障功能和促进细胞迁移,提高了猪肠上皮损伤修复,CaSR/Rac1/PLC-γ1信号途径参与了色氨酸介导的损伤修复。