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老龄化是人类面临的世界性难题。有研究证实,即使在心血管疾病其他危险因素有效控制的情况下,心血管事件的发生率仍然会随着年龄而增加,而这种差异与年龄相关的血管结构和功能的改变相关,血管年龄是心血管事件和死亡率最好的预测因素。因此进行血管老化研究的意义不言而喻。血管老化的病变涉及内膜、中膜和外膜。其中内皮细胞生物学改变在血管老化中起到重要作用。细胞骨架是指细胞质中的蛋白质纤维网架体系,与血管内皮细胞的通透性、内皮相关的血管舒缩功能、内皮凋亡、信号转导等密切相关。因此本研究在前期研究的基础上从细胞骨架层面对内皮衰老的病理改变及益气活血中药的干预作用及机制进行分析。第一部分：复制性衰老微血管内皮细胞模型的建立及其细胞骨架的观察目的：观察复制性衰老人心脏微血管内皮细胞(human cardiac microvascular endothelial cells, HCMEC)的衰老特点,分析细胞骨架F-actin和G-actin的改变。方法：采用体外培养和传代的方法建立复制性衰老模型,分别通过β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色鉴定衰老、CCK-8检测细胞增殖能力、流式细胞仪分析细胞周期等方法观察衰老改变,运用激光免疫共聚焦显微镜观察复制衰老中细胞骨架F-actin和G-actin的改变。结果：与5代细胞相比,8代HCMEC细胞体积增大,变得扁平,胞核明显甚至双核,胞浆内颗粒增加,变浑浊；SA-β-gal衰老染色约占80%,符合衰老改变；细胞增殖能力降低；细胞停滞于G0/G1期,S期和G2/M期细胞比例下降,表明8代HCMEC可以用于复制性衰老的实验研究。5代HCMEC细胞F-actin主要分布在内皮细胞边缘,线条完整连续,显示HCMEC典型的鹅卵石样轮廓；G-actin主要分布在内皮细胞中央区域,边界较为清晰圆润,呈致密圆形椭圆。8代HCMEC周边完整连续的F-actin变得毛糙不规整,出现锯齿样断裂,趋于崩解消散,部分形成应力纤维；饱满圆润的G-actin向细胞周边区域伸展移位,胞浆区出现散点状染色,部分边界变模糊。G-actin向F-actin转化增多,F/G-actin平均光密度比值下降。结论：8代HCMEC细胞可以用于复制性衰老模型的实验研究；复制性衰老HCMEC细胞骨架F-actin和G-actin的形态破坏,G-actin向F-actin转化增多,应力纤维形成。第二部分：益气活血中药对复制性衰老微血管内皮细胞改变及骨架蛋白的干预作用目的：观察人参三七川芎提取物延缓复制性衰老HCMEC的作用；分析对其细胞骨架F-actin和血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin, VE-cadherin)的干预作用。方法：通过体外培养和传代的方法建立复制性衰老HCMEC模型。实验分为5代细胞组(青年组)、8代复制性衰老模型组(衰老组)、白藜芦醇组(10μmol/L resveratrol)、中药低剂量组(50mg/L中药提取液)、中药中剂量组(100mg/L中药提取液)、中药高剂量组(200mg/L中药提取液)。采用SA-β-gal染色鉴定衰老、CCK-8检测细胞增殖能力、流式细胞仪分析细胞周期,激光免疫共聚焦显微镜观察细胞骨架F-actin和G-actin、VE-cadherin的改变,硝酸还原酶法检测细胞上清NO的含量,Real-Time PCR和western-blot方法检测各组细胞F-actin、 VE-cadherin、热休克蛋白27(heat shock protein 27, HSP27)的mRNA和蛋白表达情况。结果：与衰老组相比,人参三七川芎提取物减少复制性衰老HCMEC细胞SA-β-gal染色的比例,促进细胞的增殖,促使细胞处于S和G2/M期,增加细胞上清NO的分泌；与白藜芦醇组相比,人参三七川芎提取物促进细胞增殖和减少G0/G1期细胞比例。与衰老组相比,人参三七川芎提取物使复制性衰老HCMEC骨架蛋白F-actin线条较为完整的分布于细胞边缘,G-actin圆润饱满的分布于细胞中央,VE-cadherin连接较为完整的分布于细胞周边,F/G-actin和VE-cadherin的平均光密度值增加。与衰老组相比,人参三七川芎提取物减少F-actin的蛋白表达,增加VE-cadherin、HSP27的蛋白表达；与白藜芦醇相比,人参三七川芎提取物高剂量组VE-cadherin增多。结论：人参三七川芎提取物可以延缓微血管内皮细胞的衰老和保持内皮细胞功能,机制可能与F-actin下调、VE-cadherin和HSP27上调有关。第三部分：益气活血中药对衰老微血管内皮细胞F-actin、VE-cadherin作用机制探讨目的：分析人参三七川芎提取物对复制性衰老HCMEC细胞骨架F-actin和VE-cadherin的干预机制。方法：运用慢病毒感染的方法,建立HSP27沉默后复制性衰老HCMEC细胞模型。分组为Mock组、未敲低细胞(衰老组、白藜芦醇组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组)、基因敲低细胞(HSP27shRNA组(衰老组)、HSP27shRNA+白藜芦醇组、HSP27shRNA+中药低剂量组、HSP27shRNA+中药中剂量组、HSP27shRNA+中药高剂量组)。采用SA-β-gal染色鉴定衰老、CCK-8检测细胞增殖能力、流式细胞仪分析细胞周期,激光免疫共聚焦显微镜观察细胞骨架F-actin和G-actin、VE-cadherin的改变,硝酸还原酶法检测细胞上清NO的含量,Real-Time PCR和western-blot方法检测各组细胞F-actin、VE-cadherin的mRNA和蛋白表达情况。结果：分别与Mock组、未敲低组比较,HSP27基因敲低后人参三七川芎提取物组细胞SA-β-gal染色比例增加,增殖能力下降；F-actin外周致密带边缘变得毛糙不规整,崩解消散,细胞的形状不能清晰的呈现；G-actin表现为边缘变模糊呈絮状向外延伸,而细胞中央区域染色离散,形态不规则,F/G-actin的平均光密度值下降；VE-cadherin环状连接消失,出现大量断裂,染色不清晰,平均光密度值降低；F-actin、VE-cadherin的蛋白表达明显下降。结论：人参三七川芎提取物通过HSP27下调F-actin、上调VE-cadherin延缓微血管内皮细胞衰老。综上所述,8代HCMEC可以用于复制性衰老模型的实验研究,且细胞骨架F-actin出现形态粗糙、锯齿样断裂、应力纤维,饱满圆润的G-actin向细胞周边区域伸展移位、胞浆区出现散点状染色、边界不清晰。人参三七川芎提取物减少复制性衰老HCMEC SA-β-gal染色的比例,促进细胞的增殖和有丝分裂,维持内皮细胞功能；使骨架蛋白F-actin线条较为完整的分布于细胞边缘,G-actin圆润饱满的分布于细胞中央,VE-cadherin连接较为完整的分布于细胞周边,减少F-actin蛋白表达,增加VE-cadherin蛋白表达。通过HSP27基因敲低技术,表明了人参三七川芎提取物通过HSP27下调F-actin、上调VE-cadherin延缓微血管内皮细胞衰老。