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传统的痛觉传导学说认为,疼痛是经外周,脊髓和脑中三级神经元的传递,最终被机体感知的,常表现为不愉快的感觉或情绪体验。当持续性炎性痛发生时,神经系统中会有大量炎性介质产生,如IL-10, TNF-α等,这些炎性介质在痛敏的发生和维持过程中起着重要作用。TNF-α是由神经元和胶质细胞分泌的炎性因子,在痛信号传入时表达增多,并参与痛敏及异常疼痛的发生和维持,但它通过何种方式介导了这一过程目前并不清楚。我们实验室的前期研究表明,TNF-α可通过上调NMDA受体NR1亚基的磷酸化水平而增加痛敏的,但是TNFR有2种亚型,分别是TNFR1(55KD)和TNFR2(75KD),到底是哪种亚型介导了NR1的磷酸化还存在争论。本研究将利用siRNA技术分别沉默大鼠脊髓背角神经元TNFR1/TNFR2的表达,对TNFR介导上调pNR1的表达以及痛敏的发生机制进行更深入的研究。研究方法1.致痛模型制备及热痛行为观察雄性SD大鼠(250-270g),一侧脚掌注射弗氏佐剂(CFA,0.08ml,40μg)或生理盐水(NS)。脚掌注射的时间设为0点；鞘内给药时间分别为脚掌注射前5天(-5d)；将动物置于热板仪上测量抬足缩回的潜伏期(PWL)的时间分别为脚掌注射后的第1d、3d和7d。实验分组按照2×2双因素设计。2. Western-blot检测热板实验测量PWL结束后,快速处死动物,分离脊髓组织,在冰浴环境中用酶解缓冲液溶解,超声匀浆后离心,SDS-PAGE电泳分离蛋白,将蛋白转至PVDF膜上。经封闭、与一抗孵育、与相应二抗孵育后,检测免疫印迹。用该方法测定的指标有：TNFR1/TNFR2,pNR1。3.siRNA技术包装有干扰TNFR1/TNFR2mRNA小分子片段siRNA的腺病毒从试剂公司获取。用基因沉默的方法抑制TNFR1/TNFR2的表达：利用siRNA技术,通过腺病毒包装转染,分别将以TNFR1/TNFR2的mRNA为靶向的siRNA预先鞘内注射到大鼠脊髓的腰膨大处,分别抑制TNFR1、 TNFR2或TNFR1&2的表达。4.免疫荧光双标检测用NR1和TNFR1/2免疫荧光共标记脊髓神经元。麻醉大鼠用多聚甲醛(4%)灌流固定。用骨钳取出脊髓腰膨大部,脱水后包埋,用冰冻切片机切取30μm后的脊髓组织切片,用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS, NaCl137mmol/L, KCl2.7mmol/L, Na2HPO44.3mmol/L, KH2PO41.4mmol/L, pH7.2～7.4)漂洗三次,每次3min;加入5%的BSA封闭1h。一抗anti-NR1antibody小鼠抗大鼠(millipore, USA1:250PBS稀释),第二个一抗anti-TNFR1/2antibody (Abcam,1:250PBS稀释)兔抗大鼠,孵育,室温过夜。漂洗3次,室温下闭光孵育AlexFluo488标记驴抗小鼠IgG (Invitrogen, USA), AlexFluo594标记驴抗兔IgG(Invitrogen, USA,1:1000PBS稀释)2h。漂洗3次。贴片,封片后用Olympus正置荧光显微镜进行观察并拍照。研究内容一共分为两部分第一部分：形态学检测1.将标有绿色荧光蛋白的病毒注入腰膨大显微镜下可见绿色荧光,说明病毒确实注入了细胞内。2.显微镜下免疫荧光结果显示TNFR1或TNFR2与NMDA受体共定位。第二部分：行为学和Western blot检测。1.鞘内注射空载病毒对照组将空载病毒(GFP)注射入大鼠的腰膨大,足底分别注射CFA或生理盐水。结果：行为学的结果显示<GFP+CFA>组,与<GFP+saline>组相比较,成年雄性大鼠的左侧足底皮肤下注射炎性致痛物质CFA后进行关于热痛行为的缩爪反应观察,PWL在脚掌注射后的第1d,3d,7d较对照组减少(P<0.05),说明热痛模型建立成功。2.鞘内注射TNFR1-siRNA组将载有TNFR1-siRNA的病毒注射入大鼠的腰膨大,足底注射CFA或生理盐水。结果：行为学结果显示,与<GFP+CFA>组相比,<TNFR1-siRNA+CFA>组,大鼠腰膨大处给予TNFR1-siRNA后,动物脚掌注射CFA后进行热痛行为观察,PWL在脚掌注射后第1d,3d,7d均明显延长(P<0.05),,说明TNFR1-siRNA减弱了CFA诱导的热痛反应。Western Blot结果显示,相较<GFP+CFA>组,鞘内给予TNFR1-siRNA后,脊髓背角TNFR1和p-NR1的表达减少。3.鞘内注射TNFR2-siRNA组将载有TNFR2-siRNA的腺病毒注射入大鼠的腰膨大,足底注射CFA或生理盐水。结果：行为学结果分析,与<GFP+CFA>对照组相比,<TNFR2-siRNA+CFA>组大鼠给予TNFR2-siRNA后,脚掌射CFA引起的PWL在第1天明显延长(p<0.05),而第3,7天PWL与对照组无显著性差异。Western Blot结果显示,相较<GFP+CFA>组,鞘内给予能抑制TNFR2-siRNA,脊髓背角神经元TNFR2和p-NR1的表达减少。4.鞘内注射TNFR1&/2-siRNA组将载有TNFR1&2-siRNA注射入大鼠的腰膨大,足底分别注射CFA或生理盐水。行为学结果显示：<TNFR1/2-siRNA+CFA>组,与<GFP+CFA)相比,脚掌注射CFA后PWL值在第1d,3d和7d的可见明显延长(P<0.05),其中给予TNFR1&2-siRNA的大鼠和未给与TNFR1&2-siRNA后测的PWL显著性增加。Western Blot结果显示,相较<GFP+CFA>组,鞘内给予TNFR1&2-siRNA,脊髓p-NR1的表达明显减少。另外,与<TNFR1-siRNA+CFA>组相比,<TNFR1&2-siRNA+CFA>组大鼠的PWL在第1d,3d,7d未呈现显著性差异；而与<TNFR2-siRNA+CFA>相比,<TNFR1&2-siRNA+CFA>组的PWL值在在第3d,7d呈现显著差异(p<0.05)。研究结论脚掌注射CFA诱导的炎性持续性伤害刺激可以通过激活胶质细胞激发并促进脊髓TNF-a的释放,后者通过激活受体TNFR1/2,主要是TNFR1,上调了背角NR1亚基的磷酸化,易化了脊髓痛信号的传递而发生痛觉过敏。我们的实验也更加明确了此过程中,TNFR1是介导这一过程的主要环节,TNFR1在介导脊髓痛觉过敏的发生、发展过程中起了重要作用,TNFR2可能主要在疼痛发生的初期起一些作用。