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非生物逆境胁迫一直是影响作物产量的主要因素,因而研究主要粮食作物的抗非生物胁迫的分子机理具有重要意义。有些转录因子通过调控早期逆境诱导基因表达在作物抗逆过程中起到非常重要的作用。实验室前期的工作通过基因芯片手段比较了水稻和陆稻品种在干旱逆境胁迫下的基因表达谱差异发现HD-Zip转录因子在干旱胁迫环境下陆稻中的诱导表达量明显高于水稻中的表达量。
本文通过对水稻中HD-Zip I亚家族中OsHOX22转录因子的表达分析、突变体及过表达转基因植物在抗旱和抗盐中的反应、OsHOX22启动子中InDel位点的连锁相关分析,初步揭示了OsHOX22在水稻抗旱和抗盐过程中的作用机理。对OsHOX22转录因子的基因结构和保守结构域的比较分析表明该基因属于HD-Zip I型亚家族。OsHOX22位于水稻第四条染色体上,编码262个氨基酸.它在不同水稻组织中均有表达,在幼苗的叶片、花序以及种子中的表达量最高.对OsHOX22启动子融合GUS的定位分析表明该基因在早期幼苗的叶片、根部、剑叶和未成熟的种子颖壳上有强烈表达。幼苗期和生殖生长期是水稻对干旱胁迫最敏感的时期,OsHOX22在这两个时期表达增高,因此推测它在抗旱过程中发挥作用.同时发现OsHOX22受干旱、ABA、PEG、NaCl胁迫诱导表达,但对冷处理反应不敏感。通过对OsHOX22启动子融合GFP蛋白的诱导表达分析表明在有ABA存在的情况下报告基因的表达量明显提高。OsHOX22具有转录因子行使功能的所有特征。亚细胞定位分析发现它定位在细胞核里面。酵母中的生化实验表明OsHOX22蛋白具有转录激活活性,它的转录激活能力主要受到HB结构域和LeucineZipper结构域两个部分控制,缺少任何一个结构域它均不能发挥转录激活作用。进一步的酵母单杂交和原生质体转化实验证明OsHOX22主要是和AH2(CAA7(C/G)ATTG)的DNA序列结合并激活报告基因的表达。对陆稻和水稻中OsHOX22的基因组序列测序比较发现在OsHOX22的启动子区域存在一个InDel位点。与水稻不同品种的关联分析发现这个InDel位点上InDel A+/+的基因型主要存在于陆稻品种当中。在对康奈尔大学收集的水稻核心种质库收集的所有知道确切亚型分类的149个水稻品种分析表明43个品种带有InDel A+/+位点,其中81％品种属于热带粳稻,7.1％的品种属于温带粳稻。对203份中国水稻微核心种质材料及亚洲栽培水稻的起源种O.rufipogon和O.nivara分析没有发现InDelA+/+位点的存在。我们把两类来源不同的启动子构建到融合GUS报告基因的表达载体中发现带有InDel A+/+的启动子对ABA更加敏感。我们进而构建了InDel位点的分离群体,统计分析结果发现InDel A+/+位点与水稻籽粒的长度存在显著的正相关连锁关系,与籽粒的宽度呈显著的负相关。为了验证我们的结论,我们分析了219个意大利水稻品种,发现所有带有InDel A+/+位点的品种均为长粒品种。对OsHOX22的T-DNA插入突变体与过表达的转基因植物的抗旱及抗盐性分析表明突变体植物的抗旱及抗盐能力明显增强,相反过表达植物的抗旱及抗盐能力下降。突变体植物种子萌发对ABA敏感性降低,而幼苗的生长明显受到ABA的抑制,说明OsHOX22突变体抗逆性提高是通过ABA依赖途径发挥作用。进一步分析发现突变体叶片的气孔数目明显减少,自然失水速率比野生型明显降低,而过表达植物的变化不大。因而我们认为OsHOX22通过调节气孔数目而在水稻抗逆过程中发挥功能。以上实验结果表明OsHOX22作为一个负调节因子在水稻抗旱和抗盐过程中发挥作用。OsHOX22基因突变并没影响到水稻的主要农艺形状,因而通过降低OsHOX22基因的表达水平提高水稻抗逆能力的策略有可能在水稻抗逆育种中应用。