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糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)最严重的微血管并发症之一。这种疾病是由于伴随持续高血糖和DM状态下的血流动力学因素,导致肾小球、肾小管或肾间质的损害。足细胞和肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cells,GMCs)是肾小球中不可或缺的两类细胞,其异常的功能变化对DN的发展起到了关键的作用。外泌体是由细胞分泌的微囊泡,包含了多种分子,例如蛋白质、脂质、DNA、mi RNA和micro RNA。它们在细胞通信中的作用引起了人们的广泛关注。课题组前期研究显示,高糖(high glucose,HG)诱导的GMCs释放的外泌体可能通过携带TGF-β1细胞因子并影响足细胞功能。但是其更深入的机制暂时还不清楚。PI3K/Akt/FOXO信号通路在细胞存活和凋亡中起到了重要作用,FOXO被Akt在Thr24,Ser256,Ser319上磷酸化,促进它们的出核转运和转录激活。越来越多的证据表明F0X01具有抑癌作用,因为它在多种癌症中具有抗增殖和促凋亡活性。小檗碱(berberine,BBR)是从黄连中提取的天然化学物质,BBR具有多种药理活性,包括降血糖、降脂、抗炎、抗氧化应激作用和减少尿蛋白的产生。上述研究表明,HG刺激GMCs释放的外泌体可能对足细胞的功能产生影响,而这种作用可能是通过PI3K-AKT-FOXO1-Bim/m TORC1信号通路实现的,因此本课题拟通过分离GMCs释放的外泌体,在体外与足细胞共培养,观察足细胞的功能变化和足细胞上PI3K-AKT-FOXO1-Bim/m TORC1信号通路蛋白的表达情况,同时通过尾静脉向小鼠体内注射GMCs释放的外泌体,观察小鼠肾脏功能和肾皮质上PI3K-AKT-Bim信号通路蛋白和足细胞标志性蛋白WT-1的表达水平。通过体外实验探讨GMCs释放的外泌体造成足细胞损伤的机制,通过体内实验研究GMCs释放的外泌体对小鼠肾脏功能的影响,以及BBR在改善足细胞和肾脏损伤上的重要作用,以探讨外泌体在GMCs和足细胞之间的信号转导上所起到的作用,为BBR治疗DN提供了现代科学依据,并为鉴定药物新靶标提供了创新思路。目的:明确HG刺激GMCs源外泌体具有对足细胞损伤的作用。明确BBR对外泌体引起的足细胞损伤具备保护作用。明确HG诱导GMCs源外泌体对小鼠肾脏功能有损伤作用,明确BBR对高糖诱导GMCs源外泌体损伤小鼠肾脏具备保护作用。明确BBR保护HG诱导GMCs源外泌体对足细胞和小鼠肾脏损伤的机制可能与调节PI3K-AKT-FOXO1-Bim/m TORC1通路有关。为探讨BBR用于DN治疗药物开拓新的研究方向和思路,为临床DN的治疗打下基础。方法:使用差速超速离心法分离得到GMCs分泌的外泌体,使用Western blot法观察外泌体的标志蛋白CD63、TSG101和内质网标志蛋白Calnexin的表达程度;使用透射电镜观察外泌体的形态特征;使用马尔文粒径分析仪检测外泌体的粒径大小百分比;使用激光共聚焦显微镜观察外泌体(标记绿色荧光)被足细胞摄取的情况。使用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒确定外泌体对足细胞刺激最适浓度和BBR的最适浓度。将GMCs和足细胞共培养,分为正常组,高糖模型组和GW4869(外泌体抑制剂)组,各组给予相应刺激24 h后,利用Annexin V-FITC/PI双染法检测各组足细胞的凋亡率,使用Western blot法检测WT-1、nephrin和podocin足细胞标志蛋白的表达情况。将分离得到的外泌体和BBR依照分组与足细胞培养,利用Annexin V-FITC/PI双染法检测足细胞的凋亡率;使用Transwell小室检测足细胞迁移功能;使用Western blot法检测足细胞标志蛋白的表达情况;使用Western blot法检测足细胞上PI3K、AKT、P-AKT、FOXO1、P-FOXO1、Bim、m TORC1蛋白的表达水平。通过检测小鼠肾功能参数观察小鼠肾脏损伤情况;通过苏木精和曙红(hematoxylin and eosin,HE)染色和高碘酸-席夫(periodic acid–Schiff,PAS)染色观察小鼠肾脏病理变化;通过免疫组化法观察小鼠肾小球上WT-1蛋白的分布和表达;通过Western blot法检测小鼠肾皮质上PI3K、P-AKT、AKT和Bim蛋白的表达的水平。结果:1.提取得到的GMCs分泌物为外泌体Western blot结果显示分离物高表达CD63和TSG101蛋白,并且几乎不表达Calnexin蛋白,证明了提取物是不包含细胞碎片的纯净外泌体。透射电镜下可见分离得到的外泌体具有脂质双分子层结构,直径在40-160 nm,与文献中报道的外泌体典型特征一致。马尔文粒径分析仪检测外泌体的粒径分布情况结果显示,外泌体的最大粒子密度范围在100 nm左右。2.GMCs源外泌体被足细胞摄取激光共聚焦显微镜观察结果显示,足细胞的细胞质中存在PKH67(绿色)标记的GMCs源外泌体。这一结果确定了,足细胞可摄取GMCs分泌的外泌体。3.筛选GMCs源外泌体作用于足细胞的最佳条件使用Annexin V-FITC/PI双染法检测足细胞的凋亡率,数据表明50μg/ml的外泌体刺激足细胞24小时,足细胞的凋亡率最高,可作为最终刺激条件。4.高糖刺激GMCs分泌的外泌体参与足细胞的损伤利用Transwell小室将足细胞与GMCs共培育,结果显示,与正常组相比,高糖模型组的足细胞凋亡率显著增加,足细胞标志蛋白的表达水平显著下调,与高糖模型组比较,GW4869组中的足细胞凋亡率明显降低,足细胞标志蛋白的表达水平明显升高。5.BBR改善高糖诱导GMCs源外泌体对足细胞功能的损伤使用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡结果显示,与正常组相比,正常外泌体组中足细胞的凋亡率无明显差异,高糖外泌体组中足细胞的凋亡率显著升高,BBR高低剂量组和TGF-β1受体抑制剂组能不同程度有效降低足细胞的凋亡率。足细胞迁移能力检测结果显示,与正常组相比,正常外泌体组中足细胞的迁移能力无明显差异,高糖外泌体组中足细胞的迁移能力显著升高,BBR高低剂量组和TGF-β1受体抑制剂组能不同程度有效降低足细胞的迁移能力。Western blot检测结果显示,与正常组相比,正常外泌体组中足细胞上标志蛋白表达无显著差异,高糖外泌体组中足细胞上标志性蛋白表达显著降低,BBR高低剂量组和TGF-β1受体抑制剂组能不同程度有效上调足细胞上标志蛋白的表达。上述结果证明,BBR可通过降低足细胞的凋亡率和迁移能力,提高足细胞标志蛋白的表达来发挥对足细胞的保护作用。6.BBR改善高糖诱导GMCs源外泌体对足细胞的损伤作用可能与调节PI3K-AKT-FOXO1-Bim/m TORC1信号通路相关Western blot结果得出与正常组相比,正常外泌体组的PI3K、P-AKT/AKT、P-FOXO1/FOXO1、Bim及m TORC1蛋白表达水平无明显差异,高糖外泌体组的PI3K、P-AKT/AKT、Bim及m TORC1蛋白表达水平明显上升,P-FOXO1/FOXO1蛋白表达水平明显下降,BBR高低剂量组和TGF-β1受体抑制剂组能不同程度有效下调PI3K、P-AKT/AKT、Bim及m TORC1的蛋白表达,上调P-FOXO1/FOXO1的蛋白表达。7.高糖诱导GMCs源外泌体对小鼠肾功能参数的影响检测结果表明,与正常对照组相比,正常外泌体组的血清氮(blood urea nitrogen,BUN)、n-乙酰基-d-氨基葡萄糖苷酶(n-acetyl-d-glucosaminidase,NAG)、尿总蛋白(total urine protein,TUP)和尿肌酐(urine creatinine,UCr)等方面无明显差异,而高糖外泌体组血清标本中BUN、尿液标本中NAG、UCr、总尿蛋白水平明显升高,BBR(50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg)和依那普利阳性药对照组的上述指标有不同程度的下降。8.高糖诱导的GMCs源外泌体对小鼠肾脏组织病理学的影响小鼠肾脏HE染色和PAS染色结果显示,正常对照组和正常外泌体组肾脏组织无明显病变,肾小球结构清晰,未见肿胀、萎缩。高糖外泌体组肾小球体积明显缩小,系膜基质明显增多,基底膜弥漫性增厚,系膜区增厚。BBR(50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg)给药组、依那普利阳性对照组能不同程度改善上述病理变化,减少肾小球基底膜增厚及细胞外基质的沉积。9高糖诱导的GMCs源外泌体对小鼠肾皮质中WT-1蛋白分布和表达的影响免疫组化结果显示,正常对照组与正常外泌体组肾小球上WT-1蛋白的表达水平高、分布均匀;与正常对照组相比,高糖外泌体组肾小球上WT-1蛋白表达水平显著降低,与高糖外泌体组比,BBR(50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg)给药组和依那普利阳性药对照组不同程度的上调了肾小球中WT-1蛋白的表达水平。10 PI3K/AKT信号通路参与了高糖诱导GMCs源外泌体导致的的肾小球损伤Western blot检测结果显示,与正常对照组相比,正常外泌体组小鼠肾皮质中PI3K、p-AKT、Bim蛋白表达水平无明显变化,高糖外泌体组小鼠肾皮质中PI3K、p-AKT、Bim蛋白表达水平显著升高;与高糖外泌体组相比,BBR(100 mg/kg、200 mg/kg)给药组和依那普利阳性对照组显著降低了PI3K、p-AKT、Bim的表达水平。结论:1.HG诱导GMCs源外泌体可以影响足细胞和小鼠肾脏的功能。2.BBR能减少HG诱导GMCs源外泌体对足细胞和小鼠肾脏的损伤。3.BBR可能通过调节PI3K-AKT-FOXO1-Bim/m TORC1信号通路改善足细胞损伤。