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目的:精子鞭毛多发形态异常（Multiple morphological abnormalities of the sperm flagella,MMAF）是弱畸精子症中的严重亚型,其特征是射精的精液中出现大量不动的精子并伴有严重的精子鞭毛多种形态异常。先前的研究报道了与MMAF相关的异质性遗传图谱。然而,鉴定出的遗传变异不能完全解释MMAF导致的弱畸精子症的遗传学病因。因而本课题纳入以MMAF为主要精子表型的弱畸精子症并伴有原发性男性不育的患者为研究对象,利用全外显子测序技术（Whole exome sequencing,WES）和严格的生物信息学分析,继续寻找MMAF相关的弱畸精子症致病基因,观察并探索MMAF患者卵细胞胞浆内单精子注射（Intracytoplasmic sperm injection,ICSI）治疗结局,以期为临床上MMAF患者基因诊断、遗传咨询和治疗策略选择提供理论和实践依据。方法:研究对象来自于安徽医科大学第一附属医院妇产科生殖中心和厦门市妇幼保健院门诊就诊的7例以MMAF为主要精子表型的严重弱畸精子症男性不育患者。7例患者均为无血缘关系的汉族男性,临床精子形态学检查诊断为短尾、卷尾甚至是无尾的严重MMAF表现畸形精子症。所有病例通过仔细的病史问询,排除原发性纤毛运动障碍（Primary ciliary dyskinesia,PCD）相关的临床症状（如呼吸道反复感染,鼻窦炎、支气管炎、肺炎、支气管扩张等严重呼吸道疾病以及中耳炎、随机性的内脏位置翻转等其他系统纤毛症状）,体格检查及实验室检查显示患者的外生殖器及第二性征发育正常、内脏器官位置正常、双侧睾丸大小正常、激素水平正常。染色体核型经检测均为46,XY,且Y染色体微缺失检查排除了Y染色体微缺失的现象。进而提取7名患者的外周血DNA并进行基于WES技术和生物信息学的遗传分析。在所有7名患者WES结果中首次检测出1种新的MMAF致病基因和2种已报道的弱畸精子症男性不育致病基因的新发突变。进一步抽取患者父母的外周血并留取患者的精液样本,通过Sanger测序验证致病基因突变及其遗传模式,并基于先证者捐献的精子样本,利用扫描电镜和透射电镜分析精子超微结构的改变,借助免疫荧光和实时荧光定量PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-q PCR）检测精子中结构和功能相关蛋白及RNA在分子水平的变化。此外,我们通过CRISPR-Cas9编辑技术构建了Dnah8基因敲除小鼠模型,进一步验证该基因的小鼠同源基因缺陷是否会在小鼠中导致MMAF的发生。临床治疗上,7名MMAF患者均在采取了ICSI助孕治疗,统计并比较患者ICSI受精率、卵裂率、囊胚率并随访移植后妊娠结局。结果:7例患者的WES结果显示,3名MMAF先证者携带DNAH2基因复合杂合新发突变（F1-II-1 c.A2116C:p.K706Q,c.C11635T:p.R3879W;F2-II-1c.A5507G:p.K1836R,c.G9291T:p.E3097D;F3-II-1 c.G4774A:p.E1592K,c.G5771C:p.R1924P）,2名MMAF先证者首次发现DNAH8基因复合杂合致病性突变携带（A051-II-1 c.11771C＞T:p.Thr3924Met,c.6689A＞G:p.Lys2230Arg;X003-II-1c.9427C＞T:p.Arg3143Cys;c.12721G＞A:p.Ala4241Thr）,2名MMAF先证者携带DNAH17基因致病性复合杂合突变（A061 II-1 c.12915+1 C＞T,c.13202 G＞A:p.Pro4401Leu;A083 II-1 c.8512-2A＞G,c.13294C＞T:p.R4432C）。研究所鉴定出的突变位点在Exome Aggregation Consortium（Ex AC）,Genome Aggregation Database（gnom AD）,1000 Genomes Project（1KGP）人群数据库中罕见或不存在。（1）对于DNAH2双等位基因突变患者,精液分析表现为以短尾和无尾为主的严重弱畸精子症,超微结构分析发现其精子鞭毛轴丝内动力蛋白臂缺失。RT-q PCR和免疫荧光结果显示DNAH2表达显著下降。（2）对于DNAH8双等位基因突变患者,精液分析呈现典型伴精子鞭毛多种形态异常弱畸精子症,通过扫描电镜和透射电镜观察其精子鞭毛轴丝结构出现包括中央微管和外动力蛋白臂缺失在内的多种结构缺陷。免疫荧光实验显示DNAH8蛋白及其相互作用蛋白DNAH17的缺失或定位缺陷。进一步的,成功构建的Dnah8基因敲除小鼠模型的精子同样出现弱畸精子症表型且雄性不育,与人类患者表型一致。两例DNAH17双等位基因突变男性不育患者表现为严重的MMAF表型弱畸精子症。RT-q PCR及免疫荧光实验和透射电镜观察结果表明,DNAH17蛋白功能缺陷将导致鞭毛主段和尾段轴丝4-7号外周二联微管高比例的缺失。同时,两例患者伴有较高的精子核DNA碎片率（DNA fragmentation index,DFI）,常规ICSI结局不佳,通过ICSI联合卵子辅助激活（Assisted oocyte activation,AOA）助孕,帮助患者成功妊娠并分娩。结论:（1）DNAH2双等位基因突变将导致精子鞭毛短尾、无尾等严重畸形,进而引起男性不育。DNAH2作为内动力蛋白臂关键组分,其缺陷引起鞭毛微管内动力蛋白臂超微结构缺失和精子活力严重下降。（2）DNAH8双等位基因突变是一种新的致病基因变异,可导致典型MMAF表型的弱畸精子症。DNAH8是精子鞭毛外动力蛋白臂重要组分,DNAH8蛋白缺陷导致DNAH17蛋白尾部定位异常,协同参与精子发生及尾部鞭毛组装。（3）DNAH17新发双等位基因突变导致严重弱畸精子症并伴有不良的常规ICSI试管结局,ICSI联合AOA辅助生殖技术可以帮助患者获得健康子代,可能是该类患者有效的辅助生殖治疗方式。