黑木耳(Auricularia auricular)为木生菌,能很好地利用木质栽培基质,如木屑等。随着天然林保护工程的实施,栽培原料的紧缺极大地限制了黑木耳产业的发展。利用分子育种技术提高黑木耳对秸秆等草质栽培基质的利用效率是黑木耳栽培产业稳定、持续发展的有效途径之一。糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)既可利用木质栽培基质,又可以很好地利用草质栽培基质,对木屑和秸秆的生物转化率均很高。利用转基因技术将糙皮侧耳的草类木质素降解基因定向转育到黑木耳中,使黑木耳能够高效利用草类栽培基质,理论上是可行的。本研究针对糙皮侧耳已知的草类木质素降解相关基因知之甚少这一问题,以糙皮侧耳为研究对象,利用SSH技术,分别构建了糙皮侧耳降解稻草秸秆木质素和蒙古栎木质素cDNA文库,通过对两个文库的分析,获得各自的高效表达基因。该研究成果将为研究糙皮侧耳对不同种类木质素降解的分子机理奠定基础。主要研究结果如下：1、采用Trizol法、STE法和改进的STE法3种RNA提取方法对糙皮侧耳菌丝体进行总RNA提取。结果表明：改进的STE法提取的RNA较常规的Trizol法和单纯的STE法提取的RNA质量好,条带清晰完整,胶孔无残留蛋白等杂质。纯化后mRNA为总RNA浓度的1/50-1/100,driver和tester的OD260/OD280值分别为1.90(D),2.10(T-1)和2.08(T-2)。2、分别构建了糙皮侧耳(P. ostreatus)降解草本木质素和木本木质素cDNA文库SSH1和SSH2,文库阳性克隆比分别为75%和95%,符合一般文库要求。分别随机挑取200个和280个阳性克隆进行测序及后续去除载体等工作,SSH1和SSH2文库片段长度分别主要集中在0.25-0.5kb和0.25-0.65kb范围内。高同源性基因主要来源于双色蜡蘑(Laccaria bicolor)、灰盖鬼伞(Coprinus cinerea)、糙皮侧耳(P. ostreatus)、裂褶菌(Schizophyllum commune)和凤尾菇(Pleurotus sajurcaju)等。3、SSH1文库中冗余表达的基因有泛激素、钙调蛋白、adp-糖基化因子和精氨酸酶,冗余数分别为7、2、3、2,其中泛激素的冗余度尤为显著。与草本木质素降解相关的ESTs主要参与细胞抵抗与防御相关过程、蛋白质合成及降解和信号传导过程,包括谷胱甘肽合成酶(GSH2)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、热激蛋白(HSP)基因；泛激素-蛋白酶系统(UPS)中的泛激素、20S蛋白酶体及RBX基因；adp-糖基化因子、RhoG蛋白和钙调素等基因。4、SSH2文库基因包括新陈代谢、细胞抵御、信号转导、转录因子、蛋白质合成修饰与降解及物质转运几类,其种类数分别为22、17、10、3、7、5。与木本木质素降解相关ESTs主要为漆酶基因(Laccase)、抗氧化基因(如GR、Prx和Trx)、duf895区域膜蛋白基因、Ca2+/CaMK基因、伴刀豆球蛋白阿霉素诱导蛋白c、锌指蛋白、磷酸酮醇酶、丙酮酸脱羧酶、热激蛋白、硫氧还蛋白、双特异件蛋白磷酸酶等,其中以伴刀豆球蛋白阿霉素诱导蛋白c和锌指蛋白的冗余度最为显著。5、对文库SSH1及SSH2中的主要ESTs分别进行了较详细的分析讨论,包括GSH、GST、Rho、泛激素、RBX基因、钙调素等基因(SSH1文库)和Laccase、 Prx、GR、Trx、囊泡运输蛋白sec17、ADP/ATP转运蛋白基因等(SSH2文库)。参照KEGG数据库,文库SSH2的ESTs可能参与的代谢途径有33个,主要有次级代谢生物合成、莽草酸途径的生物碱合成、萜类和淄酮类生物碱的合成及类苯基丙烷生物合成等。综上,改进的STE法更适合糙皮侧耳菌丝体总RNA的提取。糙皮侧耳ESTs中与草本木质素降解相关的ESTs和与木本木质素降解相关的ESTs存在显著的差异,因此所参与的代谢途径可能也不同。