鸡CCT6A基因的功能及启动子区的多态性研究

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CCT是真核生物胞浆中唯一的伴侣素,属Ⅱ型伴侣素,是一种广泛存在于细胞浆中的异型寡聚蛋白,在肌动蛋白、微管蛋白的组装和折叠中发挥着重要的作用。CCT6A是CCT的ζ亚基。在开产后的鸡卵巢中CCT6A的mRNA表达量显著升高,孕激素处理鸡卵泡颗粒细胞,可显著上调CCT6A基因的表达,并发现CCT6A启动子区存在孕酮受体结合元件(PREs),表明CCT6A基因参与孕酮调控通路。以上研究揭示了CCT6A基因在卵泡发育中的重要作用。但其在鸡卵泡发育中的功能及表达调控的相关研究还很少。本研究通过qRT-PCR分析得到CCT6A基因在鸡卵泡膜细胞中的mRNA表达量显著高于颗粒细胞,并在F4卵泡膜细胞中表达量最高。通过构建鸡卵泡膜细胞的体外模型,并利用pGPU6/GFP/Neo真核表达载体为骨架,构建靶向CCT6A mRNA序列的shRNA表达载体:pGPU6/GFP/Neo-shRNA-213/699/1272/1404和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-NC。将shRNA表达载体转染进鸡卵泡膜细胞中,48h后检测,发现转染pGPU6/GFP/Neo-shRNA-1272后,CCT6A基因在mRNA和蛋白表达水平均最低并达到显著(P<0.05)。研究筛选出的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-1272表达载体能高效抑制鸡卵泡膜细胞中CCT6A mRNA和蛋白的表达。干扰CCT6A基因后BCL-2基因表达降低,抑制膜细胞增殖,细胞形态由多边形或星形变得细长,此结果表明CCT6A在鸡卵泡膜细胞增殖中发挥重要作用,为研究CCT6A在鸡卵泡发育中的功能奠定了基础。本研究通过克隆测序的方法,检测到鸡CCT6A5′调控区存在两个突变,即g.-2215T>C和g.-1959T>C。分析了两突变位点在新杨褐、海兰褐、文昌鸡、寿光鸡和鲁禽五个鸡品种中的基因型和等位基因频率,发现g.-2215T>C位点,海兰褐和鲁禽中T等位基因的频率显著高于新杨褐、文昌鸡和寿光鸡,并且新杨褐、海兰褐和文昌鸡不符合哈代温伯格平衡;g.-1959T>C位点,新杨褐和海兰褐中C等位基因频率显著高于鲁禽、寿光鸡和文昌鸡,且新杨褐群体在两突变位点偏离哈代温伯格平衡。两突变位点单倍型分析得到A、B、C和D四种单倍型,其中A (C–2215-T–1959)、C (T–2215-T–1959)和D(T–2215-C–1959)单倍型为优势单倍型,性状关联分析表明AD基因型与高产蛋量(E28)性状相关(P<0.05);AD基因型的个体F1、F5和POF1卵泡中CCT6A的mRNA表达水平均最高(P<0.05)。总之,本研究确定了干扰CCT6A基因后,BCL-2基因表达降低,抑制鸡卵泡膜细胞的增殖,检测到鸡CCT6A启动子区两突变位点g.-2215T>C和g.-1959T>C与产蛋性状相关联,AD基因型的蛋鸡的产蛋量和卵泡中CCT6A的表达量较高。此研究为进一步研究CCT6A基因的功能奠定了基础,同时也为高产蛋鸡品种培育工作提供了有效分子标记。
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