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Copine-3蛋白是由CPNE3基因编码的钙离子依赖性蛋白,是copines蛋白家族成员之一。该蛋白家族成员进化高度保守,功能多样,但是具体作用机理尚未明确。研究表明,copine-3蛋白与肿瘤等疾病的发生和发展具有相关性,其在生物体内,特别是肿瘤细胞中可能承担着重要的生物学功能。本研究首先通过western-blot和免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)发现copine-3蛋白在肺腺癌细胞系和肺腺癌患者癌组临床样品中都广泛表达,并且IHC表明copine-3蛋白主要分布在细胞质中,也有细胞核定位现象。将pEGFP-N1/CPNE3真核表达载体分别转染293T和H1299细胞,通过western-blot检测细胞亚组份和激光共聚焦观察表明copine-3蛋白定位于细胞质和细胞核中。然后,在肺腺癌A549细胞中,我们通过小干扰RNA(Small interfering RNA;siRNA)靶向干扰 CPNE3 基因表达后,Transwell实验表明细胞迁移能力显著增强(p<0.01)。利用基于细胞培养条件下稳定同位素标记(stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)的差异蛋白质组学技术,鉴定了 51个在A549细胞中siRNA介导CPNE3基因沉默后表达发生变化的蛋白质。其中,SQSTMl/p62(由SQSTM1基因编码)是CPNE3基因沉默后显著下调的蛋白质,通过RNA干扰技术,在A549细胞中干扰SQSTM1基因促进了细胞的迁移,western-blot检测显示,上皮型钙黏附蛋白E-cadherin表达下调,波形蛋白Vimentin表达上调。这表明,CPNE3基因沉默后,通过下调SQSTM1/p62表达,促进上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的发生,从而促进细胞的迁移。同时,为进一步探讨copine-3的功能,我们利用慢病毒介导的shRNA在肺腺癌A549、H1299和SPC-A1细胞株中,稳定沉默了CPNE3基因的表达。平板克隆和软琼脂克隆形成实验表明,稳定沉默CPNE3基因能够促进肺腺癌细胞的增殖。此外,我们还成功构建了人支气管上皮细胞 HBE(human bronchial epithelial cells,HBE)细胞的CPNE3基因过表达细胞株,细胞实验结果表明CPNE3基因的过表达能够抑制HBE细胞的增殖。利用基于SILAC的差异蛋白质组学技术,我们鉴定了在A549中稳定沉默CPNE3基因后的差异表达蛋白质,共获得差异表达总蛋白质59个,差异核蛋白209个。最后,对通过SILAC技术获得的在A549细胞中siRNA干扰和稳定沉默CPNE3基因后的差异蛋白质组学数据进行了生物信息学分析。Gene Ontology分析和KEGG Pathway富集,显示这些差异蛋白参与多个生物学过程和通路。同时也完成了差异蛋白的相互作用网络的分析,为后续的信号转导通路实验研究提供了线索,为进一步探究copine-3蛋白的生物学功能,阐明copine-3蛋白调控肿瘤细胞迁移和增殖机制提供前期基础。