家蚕是一种鳞翅目昆虫,由于可以吐丝结茧而被人类驯化。在上个世纪初,家蚕作为一种模式生物,为经典遗传学和生物基础科学的发展作出了重大贡献。目前,家蚕作为鳞翅目模式昆虫,成为了遗传学、生理学、分子生物学、细胞生物学和基因组学等生物学科的重要研究对象。家蚕是一种重要的经济昆虫,其合成和分泌丝蛋白的效率非常高。家蚕泌丝机制的研究也成为了研究热点。丝腺是家蚕唯一的吐丝器官,从形态和功能上可以分为三个部分：前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺。后部丝腺合成和分泌的丝素蛋白流经中部丝腺后被丝胶蛋白包裹,最后通过细长的前部丝腺管腔分泌到体外。在各种因素的综合作用下,丝素蛋白的构象发生了巨大的转变,形成了不溶于水的丝纤维。目前,家蚕丝纤维作为一种天然的高分子材料主要应用于纺织业,但是其在生物医学材料、化妆、保健等领域的应用也越来越广泛。家蚕能够在常温常压下高效地生产丝纤维,这与丝蛋白在丝腺中复杂的加工过程有关。众多的研究已经揭示,丝腺中离子成分与含量的变化与丝蛋白构象的变化相关。但是,这些研究仍只如管中窥豹,不足以揭示家蚕丝腺中丝纤维形成的整体过程。自从2004年家蚕全基因组数据库向全世界公开以来,家蚕的研究就进入了大数据时代。针对发育、免疫及丝蛋白合成等家蚕的重要生物学性状,研究者们从基因组学、转录组学和蛋白质组学等方面进行了大量的分析和梳理工作,希望能够从中找到一些复杂的生物学网络,发现新的重要的信号通路。丝纤维形成的过程即是丝蛋白构象的变化过程。丝腺腔中除了丝蛋白以外的其它蛋白必然在这个过程中起重要的作用,但到目前为止仍然没有人研究丝腺腔内究竟存在哪些蛋白以及它们所发挥的功能。因此,本研究提取了丝腺腔内的蛋白质,进行了高分辨率的shotgun LC-MS/MS蛋白质组学分析,为了揭示丝腺腔内的蛋白质的去向,我们也对蚕丝中的蛋白质进行了鉴定,然后对鉴定到的蛋白质进行了系统的功能注释和定量分析。LC-MS/MS蛋白质组学分析结果表明,丝腺腔内容物和蚕丝纤维中的蛋白酶抑制剂含量都很高。因此,我们重点分析了丝腺和蚕丝中蛋白酶抑制剂的结构特征和分类,测定了它们的活性,并纯化获得了含量较高的几个蛋白酶抑制剂。本研究重点对丝腺中Serpin类丝氨酸蛋白酶抑制剂进行了功能研究。由于我们制备的Serpin16抗体能识别三个高度同源的蛋白质：Serpin16、Serpin18和Serpin22,因此我们对这三个Serpin在不同发育时期和不同区段丝腺中的变化进行了系统的研究,测定了它们对多种蛋白酶的抑制作用,并证实了其与一种家蚕丝腺分泌的蛋白酶Bmsp82有相互作用。本研究获得的主要结果如下：1.丝腺腔内容物和蚕丝的shotgun蛋白质组学分析(1)丝腺腔内容物蛋白质的鉴定和定量分析：我们收集了两个时期的5个区段的丝腺腔内容物样品,通过LC-MS/MS鉴定到了1271个蛋白质。通过GO分类注释,可以将鉴定到的所有蛋白质归类于11个功能分类。利用iBAQ法进行非标定量分析,发现丝腺腔内胞外蛋白的种类虽然少,但是丰度远高于胞内蛋白。丝素和丝胶是丝腺腔内丰度最高的蛋白成分,从5龄第5天到上蔟第1天,3种丝素和丝胶1从中部丝腺中区和后区流向了前部丝腺和中部丝腺前区；丝胶2和丝胶3都分布于前部丝腺和中部丝腺前区腺腔内,但丝胶2下调而丝胶却3上调。其它丰度较高的蛋白质还有代谢相关蛋白、蛋白酶抑制剂和未知功能蛋白。从5龄第5天到上蔟第1天,在前部丝腺和中部丝腺前区腺腔内的代谢相关的酶类显著下调,表明在这两段丝腺腔内的生化反应发生了显著的变化。(2)蚕丝中蛋白质的鉴定和定量分析：对蚕丝样品进行LC-MS/MS分析,共鉴定到500个蛋白质。通过综合分析GO分类注释,我们将鉴定到的蚕丝蛋白质分为了8个功能分类。通过计算各个功能分类下蛋白质的分子丰度比例,发现丝素和丝胶蛋白、未知功能蛋白和蛋白酶抑制剂构成了蚕丝中三个主要的蛋白分类,其中丝素和丝胶蛋白在7种蚕丝中的分子含量为46.2%～74.7%。相对于蛋白质的分子含量,蛋白质的质量含量更真实地体现了其在样品中的丰度,由于丝素和丝胶蛋白的分子量(100kDa～400kDa)比一般蛋白质的分子量更高,因此,丝素和丝胶蛋白的相对质量含量显然要比其相对分子数含量所反映的数值更高,占各种蚕丝蛋白总质量的84.6%～96.7%。2.丝腺腔和蚕丝中蛋白酶抑制剂的结构与活性分析(1)丝腺腔内容物和蚕丝中蛋白酶抑制剂的结构分析：家蚕丝腺腔内容物和蚕丝中的蛋白酶抑制剂有51个,根据所含的不同结构域可以分为13类：Serpin、 TIL、Kunitz_BPTI、Kazal、amfpi、WAP、Pacifastin、PBP、A2M、Inhibitor_I29. Inhibitor_I68、Cystatin和proteasome inhibitor。前9类属于丝氨酸蛋白酶抑制剂,其中的6类(TIL、Kunitz_BPTl、Kazal、amfpi、WAP和Pacifastin)属于经典类丝氨酸蛋白酶抑制剂,因为它们有类似的结构和抑制机制。经典类丝氨酸蛋白酶抑制剂都富含半胱氨酸,能形成分子内的多对二硫键,具有异常稳定的结构,并且也常常包含多个串联的结构域,使得抑制效率成倍地增加。(2)丝腺腔内容物和蚕丝中蛋白酶抑制剂的活性分析：通过预测活性位点,发现丝腺分泌的蛋白酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、胰凝乳蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂和枯草杆菌蛋白酶抑制剂等。具有串联结构域的蛋白酶抑制剂由于有多个活性位点,因此具有抑制多种蛋白酶活性的潜力。利用5种商品化的蛋白酶作为靶酶,我们测定了蚕茧丝中蛋白酶抑制剂的活性和特异性,结果表明茧中存在大量的蛋白酶K抑制剂和少量的胰蛋白酶抑制剂,但不存在或者存在微量的胰凝乳蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂。细菌和真菌等微生物都能分泌枯草杆菌蛋白酶(例如蛋白酶K)来消化宿主的蛋白质,从而摄取营养和入侵其它生物。因此,蚕茧丝中大量存在的蛋白酶K抑制剂可能起到防御微生物的作用。(3)蚕丝中蛋白酶抑制剂的纯化：利用制备的胰蛋白酶亲和柱对提取的蚕茧丝蛋白进行亲和层析,我们纯化到两个胰蛋白酶抑制剂,其分子量分别为15kDa和13kDa,因此将其命名为TI15和TI13。质谱鉴定发现TI15是Kunitz家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂BmSPI51,但无法鉴定出TI13。利用制备的蛋白酶K亲和柱对提取的蚕茧丝蛋白进行亲和层析,我们纯化到一个分子量约30kDa的蛋白酶K抑制剂,将其命名为KI30。虽然没有得到可信的质谱鉴定结果,但是Western blot的结果显示出BmSPI39抗体与KI30蛋白有明显的杂交信号,表明KI30为TIL家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂,可能为BmSPI39或者是与其高度同源的蛋白。非标定量结果表明,BmSPI51和BmSPI39是蚕茧丝中含量最高的两个蛋白酶抑制剂,暗示KI30是BmSPI39的可能性很高。BmSPI51和BmSPI39都属于经典类的丝氨酸蛋白酶抑制剂,之前的研究认为它们的作用是通过抑制蛋白酶的活性来保护茧丝,使其不被降解。3.丝腺分泌的Serpin类丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达谱分析、纯化及活性测定(1)丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin16的抗体特异性检测：Serpin16是丝腺中含量最高的Serpin类丝氨酸蛋白酶抑制剂。我们利用实验室之前原核表达的Serpin16蛋白制备了多克隆抗体,通过结合双向电泳、Western blot和MALDI-TOF-MS等技术验证了此抗体的特异性。利用双向电泳分离5龄第3天的丝腺总蛋白,再进行Western blot分析,发现Serpin16的抗体能够杂交到两个蛋白点,命名为spotl和spot2。利用MALDI-TOF-MS对这两个蛋白点进行了鉴定,发现spotl只包含了Serpin16特有的肽段,而spot2既包含了Serpin18特有的肽段也包含了Serpin22特有的肽段,表明Serpin16抗体能够识别Serpin16、Serpin18和Serpin22三个蛋白。这是由于这三个蛋白的氨基酸序列同源性非常高而造成的。我们利用该抗体调查了Serpin16、Serpin18和Serpin22三个蛋白的表达特征。(2) Serpin16、Serpin18和Serpin22的合成与分泌：半定量RT-PCR的结果表明家蚕Serpin16、Serpin18和Serpin22基因都在5龄第7天之前的家蚕中部丝腺前区表达。通过Western blot在蛋白水平也得到了类似的结果：Serpin16、Serpin18和Serpin22蛋白都存在于中部丝腺前区和前部丝腺中；Serpin16从5龄第1天到5龄第5天含量逐渐升高,之后含量降低；而Serpin18和Serpin22蛋白是从5龄初期到5龄第7天含量升高,之后含量降低。Western blot和免疫荧光的结果表明它们主要分布于中部丝腺前区的腔内。综合以上结果,我们发现Serpin16、Serpin18和Serpin22从5龄初期到中期由家蚕中部丝腺前区细胞合成,然后分泌到丝腺腔中,吐丝之前含量开始减少。(3) Serpin16、Serpin18和Serpin22的纯化与活性测定：通过综合利用阴离子交换层析和凝胶过滤的方法,我们从5龄第5天家蚕的中部丝腺前区腔内容物中分离纯化到了Serpin16、Serpin18和Serpin22蛋白。活性测定结果表明,它们对枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶具有较强的抑制活性,而对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶的抑制活性较低。由于这3个Serpin蛋白都存在于中部丝腺前区的腔内,因此我们对中部丝腺前区腔内的蛋白进行酶活测定,结果表明5龄第5天蛋白酶活性还很低,但是到5龄第7天蛋白酶活性显著升高,而Serpin16、Serpin18和Serpin22表现出对5龄第7天中部丝腺前区腔内蛋白酶活性的显著抑制作用。综合以上结果发现,在吐丝之前的5龄第7天,中部丝腺前区腔内蛋白酶的活性显著升高,与此同时,它们的抑制剂Serpin16、Serpin18和Serpin22的含量显著降低。我们推测Serpin16、Serpin18和Serpin22可能的作用是将其靶蛋白酶限制于特定时期的丝腺的特定部位。4.丝腺分泌的Serpin类丝氨酸蛋白酶抑制剂与蛋白酶的相互作用(1)丝氨酸蛋白酶BmSP82的表达特征分析：非标定量的结果表明丝腺腔内的丝氨酸蛋白酶BmSP82在丝腺中的含量远高于其它蛋白酶,且主要存在于中部丝腺前区,这与Serpin的表达特征类似,因此我们推测其是Serpin16、Serpin18和Serpin22的潜在靶酶。利用半定量RT-PCR技术,我们调查了BmSP82的表达特征,发现BmSP82只在马氏管和丝腺中表达,将丝腺细分为5个区段后,发现BmSP82在中部丝腺前区的表达量很高,在丝腺的其它区段表达量较低,与Serpin16、 Serpinl8和Serpin22的组织表达特征类似。时期表达谱结果表明,BmSP82在整个5龄期都有较高的表达量,在5龄第5天到5龄第7天期间表达量最高,与Serpin16、 Serpinl8和Serpin22的时期表达特征不同。(2)丝氨酸蛋白酶BmSP82与Serpin、Serpin18和Serpin22的相互作用：我们成功构建了BmSP82的重组表达质粒,转化毕赤酵母后,利用含G418的平板筛选到了多拷贝转化子,利用甲醇诱导表达获得了分泌到酵母细胞外的BmSP82蛋白。丝氨酸蛋白酶BmSP82酶原由N端的CUB结构域和C端的催化结构域两部分组成。我们利用胰蛋白酶水解切割BmSP82酶原,使催化结构域与CUB结构域分离,从而激活成为成熟体酶。将成熟体酶与Serpin、Serpinl8和Serpin22蛋白进行孵育,然后通过Western blot方法检测,发现BmSP82与Serpin16、Serpin18和Serpin22能够结合形成分子量更大的蛋白复合物,表明BmSP82是Serpin16、 Serpin18和Serpin22的潜在靶酶,我们还将进行下一步的验证。