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多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是以内分泌紊乱为主、多种代谢异常共同导致的一种女性内分泌疾病,该疾病会使女性出现月经不调、排卵障碍等内分泌失调的现象,导致不孕。PCOS患者双侧卵巢虽有大量窦卵泡,但是不能周期性形成成熟卵泡,目前虽有一些的病理研究,但其病理机制尚不十分清楚。此前对PCOS不排卵的病理基础的研究显示,PCOS可能是由原发性、内在性卵泡生长异常所导致的。高雄激素在PCOS的发病过程中起到非常重要的作用。卵巢中的雄激素过高抑制卵泡的生长发育,进而阻止优势卵泡的成熟,最终导致卵泡出现异常闭锁,致使卵巢呈多囊性改变(PCO)；与此同时,雄激素增多造成下丘脑-垂体-促性腺激素轴功能紊乱,促进胰岛素的持续增高,从而刺激PCOS患者黄体生成激素(LH)增高,较高的LH又促进卵巢和肾上腺分泌雄激素,如此形成持续无排卵的恶性循环。科学研究表明,卵丘颗粒细胞的凋亡调控失常与内在性的卵泡异常发育可能存在一定的联系。通过对PCOS患者的研究发现,卵丘颗粒细胞内部存在着抗凋亡与促凋亡两种状态之间的失衡,这一现象与PCOS患者血清的雄激素水平过高有密切的关系。小鼠颗粒细胞凋亡可由高雄激素血症诱导,研究发现,睾酮可诱导小鼠颗粒细胞凋亡,且活性Caspase-3表达增加,而在由雄激素过高诱导的多囊卵巢综合征大鼠模型实验中,发现大鼠卵丘颗粒细胞的凋亡率显著增加。最新研究成果显示内质网应激(ERS)参与凋亡途径的启动。为恢复细胞功能,生物体通过激活未折叠蛋白反应(UPR)修复ERS引起的细胞损伤,如果造成损伤严重,不能及时恢复,ERS将引起细胞的凋亡。大量研究证明,卵丘颗粒细胞的凋亡情况,直接影响了相应卵母细胞的生长、发育、成熟乃至后期的受精以及相应胚胎发育的质量。这表明卵母细胞与卵丘颗粒细胞之间,存在某些广泛而复杂的黏着机制。而在这种机制中,包括间隙连接在内的细胞间相互作用,在卵母细胞的发育过程中起着重要的调节作用。Lee等在早期研究中,报道了卵丘颗粒细胞凋亡与PCOS患者的年龄、受精率、获卵数目和IVF的结局有关,因而提出了,利用卵丘颗粒细胞的凋亡状态预测IVF结局的结论。曹义娟等将人卵子进行体外培养,研究人卵丘颗粒细胞凋亡率与卵母细胞发育潜能两者之间的关系,研究结果表明,卵母细胞成熟度越低,颗粒细胞凋亡率反而越高；且随着卵母细胞发育潜能和评分的下降,颗粒细胞凋亡率随之升高。国内研究提示卵子的发育潜能与卵丘颗粒细胞的生长状态紧密相关；卵丘颗粒细胞的凋亡影响卵子的成熟、受精和卵裂,卵丘颗粒细胞凋亡与卵子受精、胚胎质量及妊娠结局密切相关。综上所述,本课题在前人研究的理论与实验基础上,重点研究了PCOS患者卵丘颗粒细胞凋亡与多囊卵巢综合征发病机制之间的关系,同时就多囊卵巢综合征患者血清游离睾酮指数水平与卵丘颗粒细胞凋亡关系进行了研究,通过降低雄激素水平,研究其对多囊卵巢综合征患者卵丘颗粒细胞凋亡的影响。目的：1.明确血清游离睾酮指数水平异常的PCOS患者、降雄治疗后血清游离睾酮指数水平正常的PCOS患者、正常卵巢反应性不孕患者卵丘颗粒细胞凋亡率,探讨游离睾酮指数水平在高雄激素血症、多囊卵巢综合征(PCOS)不孕患者诊断的过程中价值。2.检测凋亡调控蛋白Caspase3、Bel-2和内质网应激蛋白CHOP的表达。3.研究受精后胚胎质量及其相应卵丘颗粒细胞凋亡率的相关性,了解卵丘颗粒细胞凋亡对PCOS卵子发育潜能的影响,指导PCOS的治疗。方法：1.选取南方医科大学南方医院生殖中心首次进行IVF-ET治疗的不孕患者60例。通过筛选,将满足条件的患者分为3组：(1)试验组：降雄治疗(口服达英-35)后游离睾酮指数水平正常的PCOS患者；(2)对照组：游离睾酮指数升高的PCOS患者(不采取口服达英-35降雄)；(3)正常对照组：正常卵巢反应不孕患者。所有患者,经超促排卵治疗后,取卵及拾卵,进行拆卵及卵子质量评估,之后进行体外受精。2.采用黄体中期长方案,在前一个月经周期的黄体中期开始使用GnRH-a,发挥降调节作用后,在垂体降调节基础上启动Gn,阴道B超监测卵泡数目和卵泡直径,当2个以上卵泡直径≥18mm时,注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)5000-10000U促使排卵。受精率为受精数与获卵数之比。3.受精后,行以下指标检测与统计：年龄、体重指数(Body Mass Index、基础FSH、Gn(Gonadotropin)天数、获卵数、受精率、优质胚胎率、雌二醇(estradiol, E2)、催乳素(prolactin, PRL)、总睾酮(testosterone,T)、性激素结合球蛋白(sex hormone-binding globulin, SHBG)、游离睾酮指数(Free androgen index, FAI)。4.所有患者,经手术获取卵丘颗粒细胞之后,行以下实验：(1)3一末端原位标记法(TUNEL)以及流式细胞法分析卵丘颗粒细胞凋亡情况,比较三组样本凋亡率差异；(2)Real-Time PCR与Western Blotting检测内质网应激蛋白CHOP蛋白、凋亡调控蛋白Bcl-2和Caspase3在卵丘颗粒细胞表达情况,对比三组间的差异。(3)对胚胎进行形态观察后,进行胚胎移植,黄体支持和临床妊娠随访,统计妊娠率。结果：通过筛选,符合标准入组的患者60例,试验组、对照组以及正常对照组各20例：①试验组：口服达英-35后,游离睾酮指数水平正常的PCOS患者；②对照组：游离睾酮指数升高的PCOS患者,不采取口服达英-35降雄；③正常对照组采用正常卵巢反应不孕患者。获得实验结果如下：1.基本临床资料及助孕情况三组患者基本特征,包括年龄、BMI、基础FSH、Gn使用天数比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.获卵、胚胎情况(1)对照组、试验组以及正常对照组获卵数的比较：与对照组相比,正常对照组以及试验组获卵数两组间无显著性差异(P>0.05)；正常对照组与试验组相比,获卵数组间无显著性差异(P>0.05)。(2)试验组、对照组以及正常对照组优质胚胎率、MⅡ期卵子数以及受精率比较：与对照组相比,试验组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；正常对照组高于对照组,结果具有统计学意义(P<0.05),表明试验组、正常对照组的卵母细胞质量高于对照组。(3)试验组、对照组以及正常对照组FAI比较：与对照组相比,试验组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；然而试验组与正常对照组FAI比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3.利用TUNEL法检查卵丘颗粒细胞凋亡率,流式细胞仪分析验证其凋亡。(1)对照组、试验组和正常对照组卵丘颗粒细胞凋亡率结果表明：与对照组相比,试验组凋亡率低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；对照组高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；试验组与正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)Real-Time PCR检测CHOP、Bcl-2和Caspase3mRNA表达水平表明：各组颗粒细胞上都有CHOP、Bcl-2和Caspase3mRNA的表达。三组Bcl-2的表达差异无统计学意义；与对照组相比,试验组和正常对照组Caspase3、CHOP表达显著下调(P<0.05)；与正常对照组相比,试验组Bcl-2、Caspase3与CHOP表达差异无统计学意义(P>0.05)。(3)Western Blotting检测CHOP、Bcl-2和Caspase3蛋白表达水平表明：各组颗粒细胞上都有CHOP、Bcl-2和Caspase3蛋白的表达。三组Bcl-2蛋白表达水平差异无统计学意义；与对照组相比,试验组和正常对照组CHOP、Caspase3蛋白表达水平显著下调(P<0.05)；与正常对照组相比,试验组Bcl-2、Caspase3与CHOP三者表达均无显著差异(P>0.05)。4.临床妊娠随访统计表明：试验组、对照组以及正常对照组临床妊娠率比较：与对照组比较,试验组与正常对照组临床妊娠率有增高的趋势,差异具有统计学意义(P<0.05),与正常对照组相比,试验组差异无统计学意义(P>0.05)。结论：本课题通过实验,直接观察经过降雄治疗后的PCOS患者以及FAI升高的PCOS患者以及正常卵巢反应性不孕患者受精后胚胎质量及卵丘颗粒细胞凋亡率。通过比较发现,经过降雄治疗后,PCOS患者经体外受精后,受精率以及胚胎质量得到了显著提高,提高了卵母细胞质量,卵丘颗粒细胞凋亡率显著降低。表明在PCOS发病过程中,血清游离睾酮指数可能提示卵丘颗粒细胞凋亡率以及受精后优质胚胎率和妊娠结局。血清游离睾酮指数越高,卵丘颗粒细胞凋亡率越高,受精后优质胚胎率越低,临床妊娠率越低。诊断PCOS生化指标可以首选FAI,因为其不仅能准确反映雄激素水平,还能间接反映卵丘颗粒细胞凋亡率,受精后优质胚胎率以及临床妊娠率,较单纯查总睾酮或游离睾酮有较大优势,有临床应用价值。