从植物中分离安全有效的抗癌活性成分是寻找新抗癌药物的途径之一。白黎芦醇(resveratrol)就是一种具有广谱生物活性的天然多酚类化合物,主要存在于葡萄、黎芦、花生等70多种植物中。大量研究证实白黎芦醇具有抗炎、抗氧化、调节脂质代谢、抑制血小板凝集、保护心血管等作用。近年来的研究表明,白黎芦醇抑制肿瘤细胞增殖,已被证实具有较为肯定的抗肿瘤作用,是一种很有希望的天然绿色防癌剂,有着广泛的临床应用前景。现已发现它对肝细胞癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病、卵巢癌等多种肿瘤细胞的生长有抑制作用。进一步的机制研究表明,白黎芦醇主要是通过p53依赖方式诱导细胞凋亡,即引起细胞内p53蛋白水平升高,从而激活一系列p53下游靶基因的转录,诱导细胞凋亡和细胞分化,保护基因组的完整性以及抑制肿瘤的发生。但是,在人类肿瘤中大多数为p53抑癌基因突变,已知乳腺癌组织p53基因的突变率为15%—60%。因此,探索通过基因干预方法增加白藜芦醇诱导肿瘤细胞凋亡的敏感性,将会使其具有更强的特异性和更大的应用价值。ASPP (apoptosis-stimulating protein of p53)是2001年英国Ludwig肿瘤研究所发现的一个新的蛋白质家族,成员包括ASPP1、ASPP2和iASPP。研究证明,iASPP是抑制凋亡的癌基因,与此相反ASPP1、ASPP2则是抑癌基因。ASPP1和(或)ASPP2通过增强p53的促凋亡基因启动子与DNA结合,从而促进细胞发生凋亡。此外,ASPP1及ASPP2能够和p53结合共同调节p53蛋白的生物学活性,促进DNA损伤的细胞发生。在人类乳腺癌和一些表达野生型p53的其他肿瘤组织中发现,ASPP1和ASPP2的mRNA的表达水平均较正常组下降。并且ASPP2表达相对高的患者存活时间长,而ASPP2表达相对低的患者存活时间短,预后较差。这些研究结果提示了ASPP的表达改变有可能与肿瘤的发生、癌症的恶性程度以及对化疗药物的敏感性有关。那么在肿瘤细胞p53变异情况下白藜芦醇如果仍诱导癌细胞凋亡,ASPP1和ASPP2基因是否起到了一定的协同或者替代p53信号通路的作用?改变ASPP1和ASPP2基因的表达是否能增强肿瘤细胞对白藜芦醇诱导凋亡的敏感性?均未见报道。因此,本实验选择乳腺癌细胞MCF-7(野生型p53)、MDA-MB-231(突变型p53),观察白藜芦醇处理后的乳腺癌细胞中ASPP1和ASPP2基因的表达,以及改变ASPP1和ASPP2基因表达强度后是否会影响乳腺癌细胞的凋亡,并且对其作用通路和机制做了初步探讨,为增强白藜芦醇药物敏感性提供思路。第一部分白藜芦醇诱导乳腺癌细胞凋亡过程中ASPP1、ASPP2基因的表达目的检测白藜芦醇作用MCF-7(野生型p53)和MDA-MB-231(突变型p53)乳腺癌细胞后ASPP1和ASPP2的表达。方法1.采用MTT方法检测不同浓度(0、1.7、5.6、16.7、50gM)白藜芦醇对MCF-7和MDA-MB-231的生长抑制的影响。2. Western blot方法检测经白藜芦醇处理后,MCF-7、MDA-MB-231和MCF-7/Caspase3细胞株细胞中PARP的蛋白水平变化。3.采用RT-PCR、Western blot检测经白藜芦醇处理后,MCF-7、MDA-MB-231细胞中ASPP1和ASPP2的mRNA和蛋白水平的变化。结果1.白藜芦醇对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB231的生长均有抑制作用,且呈浓度依赖性。2.MCF-7和MDA-MB-231细胞中ASPP1和ASPP2的mRNA和蛋白水平表达均比较低,与MDA-MB-231相比,MCF-7细胞中ASPP2的蛋白水平表达更低。当白藜芦醇作用于细胞后,与对照组相比,ASPP1和ASPP2的nRNA和蛋白水平表达均升高,且随着药物浓度增高而表达增高,并且ASPP1和ASPP2的nRNA和蛋白水平表达与肿瘤细胞的凋亡呈正相关。结论白藜芦醇诱导乳腺癌细胞ASPP1、ASPP2基因的高表达。第二部分ASPP1、ASPP2基因在白藜芦醇诱导乳腺癌细胞凋亡中的作用目的探讨ASPP1和ASPP2基因的表达改变是否影响白藜芦醇的药物敏感性。方法1.用脂质体法将pcDNA3/ASPP1和pcDNA3/ASPP2质粒分别转染入乳腺癌细胞(MCF-7)中,经G418筛选获得阳性克隆细胞株,对细胞株进行ASPP1和ASPP2基因表达鉴定。2.MTT检测高表达ASPP1、ASPP2基因对MCF-7细胞株增殖的影响,同时Apoptosis Elisa法检测对细胞凋亡的影响。RT-PCR检测白藜芦醇作用高表达ASPP1、ASPP2基因的MCF-7细胞后,Bax和p21的表达。3. MDA-MB-231细胞体外瞬时转染质粒pcDNA3/ASPP1和pcDNA3/ASPP2,同时设空质粒pcDNA3.1作为对照载体。MTT检测瞬时转染质粒ASPP1、ASPP2DNA后MDA-MB-231经白藜芦醇处理后的细胞存活率。4.选用实验室构建的Caspase3稳定表达的MCF-7/Caspase3细胞株,MTT法对比检测白藜芦醇处理后MCF-7、MCF-7/Caspase3细胞的生长曲线；采用Apoptosis Elisa法检测MCF-7、MCF-7/Caspase3细胞凋亡率进行对比。5. MCF-7/Caspase3细胞体外瞬时转染质粒pcDNA3/ASPP1和pcDNA3/ASPP2,同时设空质粒pcDNA3.1作为对照载体。MTT法检测瞬时转染质粒ASPP1、ASPP2DNA后MCF-7/Caspase3经白藜芦醇处理后的细胞存活率。结果1.经过4周G418筛选和Western blot鉴定,获得稳定表达ASPP1或ASPP22.的MCF-7细胞,命名为MCF-7/ASPP1、MCF-7/ASPP2细胞。3.MTT结果表明,细胞以白藜芦醇25μM、50μM处理4天后,白藜芦醇对MCF-7/ASPP1、MCF-7/ASPP2细胞的生长均有更明显的抑制作用。差异有显著性(P<0.05)。采用凋亡检测试剂盒检测MCF-7、MCF-7/ASPP1、MCF-7/ASPP2各组细胞凋亡率,细胞以白藜芦醇100μM、200μM处理后,结果表明,与MCF-7细胞相比,MCF-7/ASPP1、MCF-7/ASPP2细胞凋亡率明显增高。RT-PCR法对比分析MCF-7、MCF-7/ASPP1、MCF-7/ASPP2细胞中p53的下游调控相关因子基因表达差异。结果显示：与MCF-7细胞相比,MCF-7/ASPP1、MCF-7/ASPP2细胞中Bax和p21mRNA表达水平均有所增高,且在MCF-7/ASPP2细胞中的表达最高。4.采用MTT法检测瞬时转染pcDNA3/ASPP1和pcDNA3/ASPP2质粒联合白藜芦醇对MDA-MB231细胞的增殖抑制作用,与对照组转染空载体pcDNA3.1+转染组相比,其余各组细胞抑制率均明显增加,差异均具有显著性(P<0.001)。单纯白藜芦醇(50μM)处理和转染空载体组细胞抑制率升高,单纯转染pcDNA3/ASPP1和pcDNA3/ASPP2质粒的细胞的生长抑制率升高,白藜芦醇(50μM)处理并且转染ASPP1、ASPP2的细胞的生长抑制率最高。5.MTT实验结果表明,以白藜芦醇25μM、50μM处理MCF-7、MCF-7/Caspase3细胞96小时,白藜芦醇对MCF-7/Caspase3细胞的生长均有更明显的抑制作用,差异有显著性(P<0.05)。采用凋亡检测试剂盒检测MCF-7、MCF-7/Caspase3细胞凋亡率,细胞以白藜芦醇100μM、200μM处理后,结果表明,MCF-7/Caspase3细胞凋亡率明显高于MCF-7细胞。6.采用MTT法检测瞬时转染pcDNA3/ASPP1和pcDNA3/ASPP2质粒联合白藜芦醇对MCF-7/Caspase3细胞的增殖抑制作用。与对照组转染空载体pcDNA3.1+转染组相比,其余各组细胞抑制率均明显增加,差异均具有显著性(P<0.001)。单纯白藜芦醇(50μM)处理和转染空载体组细胞抑制率升高,单纯转染pcDNA3/ASPP1和pcDNA3/ASPP2质粒的细胞的生长抑制率升高,白藜芦醇(50μM)处理并且转染pcDNA3/ASPP1和pcDNA3/ASPP2质粒的细胞的生长抑制率最高。结论1. ASPP1、ASPP2高表达可增强乳腺癌细胞对白藜芦醇的敏感性,并且随着浓度增高而敏感性增强。2.相比ASPP1基因,ASPP2基因更能促进白藜芦醇对乳腺癌细胞的凋亡作用。3.MCF-7同时高表达caspase-3和ASPP1、ASPP2基因时,白藜芦醇对乳腺癌细胞的诱导凋亡作用增强。第三部分白藜芦醇诱导活化ASPP1、ASPP2基因表达的机制研究目的初步研究白藜芦醇活化ASPP1、ASPP2基因诱导凋亡的信号通路。方法1.采用RT-PCR、Western blot方法检测经白藜芦醇处理后,MCF-7、MDA-MB-231细胞中E2F-1基因mRNA和蛋白水平的变化。2.扩增、收取重组E2F-1腺病毒。重组E2F-1腺病毒感染细胞MCF-7、MDA-MB-231,白藜芦醇处理后提取蛋白,Western blot检测细胞感染腺病毒后,细胞内E2F-1、ASPP1、ASPP2的蛋白表达。3. RT-PCR方法检测E2F-1siRNA转染细胞和白藜芦醇处理后,MCF-7、MDA-MB-231细胞中E2F-1、ASPP1、ASPP2mRNA表达变化。结果1.E2F-1在MCF-7和MDA-MB231细胞内均有表达。当白藜芦醇以1.9、5.6、16.7、50μM作用细胞后,E2F-1蛋白水平、mRNA表达水平随着白藜芦醇浓度增高逐渐增高。2.E2F-1腺病毒感染MCF-7和MDA-MB231细胞后,细胞内E2F-1蛋白水平表达升高。细胞感染E2F-1腺病毒联合白藜芦醇处理组,E2F-1蛋白表达升高；MCF-7和MDA-MB231细胞感染E2F-1腺病毒组ASPP1、ASPP2表达比对照组(感染对照病毒)升高。细胞感染E2F-1腺病毒联合白藜芦醇处理组,与单纯白藜芦醇处理组相比,ASPP1、ASPP2mRNA表达水平升高。3.MCF-7和MDA-MB231细胞转染E2F-1siRNA24小时后,提取细胞RNA,RT-PCR结果表明细胞内E2F-1mRNA水平抑制。转染E2F-1siRNA联合白藜芦醇处理组,E2F-1mRNA表达升高；MCF-7和MDA-MB231细胞转染E2F-1siRNA组ASPP1、ASPP2表达和对照组没有明显差异。当用白藜芦醇50μM作用细胞后,ASPP1、ASPP2mRNA表达水平升高。细胞转染E2F-1siRNA联合白藜芦醇处理组,与单纯白藜芦醇处理组相比,ASPP1、ASPP2mRNA表达水平降低。结论1.白藜芦醇上调E2F-1基因的表达。2. ASPP1和ASPP2是E2F-1的下游靶分子基因。白藜芦醇通过对细胞E2F-1的激活,进而诱导下游基因ASPP1和ASPP2的表达,增强p53的功能,通过p53下游的靶基因诱导细胞凋亡,对肿瘤细胞的生长起到明显的抑制作用。