研究背景关节韧带损伤在日常生活中较为常见，据统计在美国每年约有6‰的人发生前十字韧带损伤，其中约半数需要手术重建。随着现代关节外科的迅速发展，对人工韧带材料的安全性和生物替代性的相关研究已成为目前关注的热点问题，而材料介导下细胞的迁移是材料对细胞其它生物学功能影响的基础。人工材料的生物替代过程依赖于其对植入区生物细胞迁移的诱导性能，这是生物材料对细胞生物学功能产生影响的前提基础。体内细胞的迁移过程需经历四个步骤：细胞首先通过与细胞外基质（ECM）建立新的粘附连接，使细胞与ECM相固定，之后细胞前端沿迁移方向伸出片状伪足，并与前方ECM粘附以维持伸张状态，随后细胞内的肌动蛋白、肌球蛋白发挥作用调节细胞体的收缩，促使细胞向前运动，最后细胞尾部与ECM分离并通过收缩将尾部抬起向前，完成迁移过程。大量研究表明，因生物材料本身性质的不同，以及生物支架工程设计的不同，对细胞生长、迁移等多种生物学功能均有一定影响。这提示我们，通过研究材料的生物学效应和生物支架空间结构与细胞学之间的关系，将有助于进一步提高材料的生物安全性和生物替代性，为临床疾病的治疗提供更好的手段。以聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）纤维为原料研制的人工韧带是目前关节外科修复重建损伤韧带的重要材料。我们的前期研究发现PET人工韧带材料经壳聚糖接枝改性后生物相容性和浸润性大大提高，提示改性后的新型PET材料具有作为人工韧带的良好潜质，但将其编织物对细胞的生物学行为的影响尚待深入研究。人工韧带在植入后，骨髓间充质干细胞(BMSC)是植入区的主要细胞之一，其可在应力作用下完成细胞定向分化，而BMSC向人工韧带的迁移过程受材料编织物的微孔结构、张力和生物相容性等诸多因素影响。因此，研究细胞在生物材料上的迁移能力及相关机制具有重要意义。Rho家族小分子鸟苷三磷酸酶，是介导多种细胞生物学功能的重要分子信号通路之一，也是整合多种细胞内信号通路的共同信号分子，具有分子开关的作用。研究表明Rho家族在细胞骨架、基因转录、细胞粘附的调控及多条信号通路的调节中的调控作用不可或缺。Rho家族作为Ras超家族成员，是MAPK系统上游的一类重要的信号转导分子，其中对RhoA、Cdc42和Rac3个成员的主要作用机制研究相对明确。而RhoA在细胞迁移过程中发挥了非常重要的作用，它所介导的RhoA/ROCK通路被称为是细胞运动的动力马达。RhoA为单体G蛋白，结构序列相对保守。 RhoA受固有的激活机制调控，RhoGTPases以无活性的结合GDP形式或有活性的结合GTP形式存在，通过两者间的相互转换发挥调节作用。RhoA活化后通过激活下游效应分子ROCK来启动通路。ROCK是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其激活后可以对下游底物进行磷酸化。在细胞迁移时，ROCK活化后可以对下游底物肌球蛋白轻链磷酸酶（Myosin light chainphosphatase，MLCP）进行磷酸化，或者直接对肌球蛋白轻链磷酸化。通过这两种途径增加了细胞内肌球蛋白轻链的磷酸化水平，刺激了由肌球蛋白和肌动蛋白的交联，增强了肌动蛋白收缩。ROCK还可以激活LIM激酶，LIM激酶激活后可使肌动蛋白解聚和切割因子失活。此外，ROCK还能激活丝切蛋白，从而增加和稳定了肌动蛋白丝。以上述信号通路的共同作用为核心，最终引起细胞发生迁移。目的1.建立可应用于体外细胞在生物材料编织物上迁移的模型；2. RhoA/ROCK信号通路在PET编织物介导小鼠BMSC迁移中的影响；方法1.利用医用316L不锈钢设计制作细胞迁移模具，置于六孔板，在模具加样孔内接种小鼠BMSC，培养24h后撤出模具，分别继续培养24h、48h和72h；2.在证实模具可有效用于量化细胞迁移过程后，将不同线密度经改性的PET材料编织物平铺于六孔板底，利用本模型观察BMSC在3000D组和5000D组材料编织物上的迁移能力，吉姆萨染色法计算不同时间点BMSC的迁移面积；3.建立在PET材料编织物上培养的小鼠BMSC的迁移模型，依材料不同分为3000DA编织方法组、3000D B编织方法组、5000D A编织方法组和5000D B编织方法组，分别培养96h后采用吉姆萨染色法和Western blot法观察细胞的迁移过程及RhoA蛋白的表达变化；4.用浓度分别为0、5、10、20μmol/L的ROCK激酶抑制剂Y27632处理小鼠BMSC，在5000DA编织方法PET材料上培养96h，利用吉姆萨染色法和Westernblot法观察细胞迁移的快慢及其对RhoA、ROCK和p-MLC蛋白表达的影响。结果1.细胞接种24h后取出模具，见六孔板底中央区出现与模具底面大小相当的无细胞区。随培养时间延长，BMSC逐渐由周围向中央区域迁移；2.在经改性的PET材料编织物上成功建立细胞迁移模型后，吉姆萨染色提示，随培养时间增加，两组细胞迁移面积均逐渐增大，其中3000D组细胞迁移面积显著大于5000D组（P <0.05）；3.吉姆萨染色法发现，5000D A编织方法组细胞迁移面积明显优于其余3组（P <0.05），3000D A编织方法组次之，5000DB编织方法组优于3000D B编织方法组。Western blot结果提示RhoA蛋白表达量的变化趋势与吉姆萨染色相同；4.在5000D A编织方法的PET编织物上建立细胞迁移模型，应用ROCK激酶抑制剂Y27632后，吉姆萨染色及Westernblot检测发现，随Y27632抑制剂浓度增高，其细胞的迁移面积逐渐减小，RhoA蛋白、ROCK蛋白和p-MLC蛋白表达量下降(P<0.05)。结论1.用医用316L不锈钢模具建立的细胞迁移模型可应用于人工材料编织物引导细胞迁移的基础研究；2.经改性的PET材料编织物的线密度对小鼠BMSC的迁移能力具有一定影响；3.生物材料因特性差异和编织方法不同使得编织物拥有不同微孔结构，影响了细胞的迁移过程，RhoA/ROCK信号通路可能是介导这一改变的主要调控分子之一。