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干细胞和已分化细胞都具有细胞可塑性,即能够在一定条件下可逆地去分化或转分化形成多谱系的细胞。这种环境引导的细胞可塑性是组织内环境稳定、再生和性逆转的基础。表观遗传调控如DNA甲基化,miRNA,组蛋白修饰和染色质重塑等在细胞可塑性方面扮演者重要的角色。斑马鱼作为再生能力很强的模式动物,其性腺,心脏,尾鳍等组织再生过程中伴随着芽基形成和重建。本课题主要以斑马鱼的性腺和心脏为例分别研究miRNA和组蛋白修饰在斑马鱼性腺和心脏可塑性再生的分子机制。1.miRNA在斑马鱼性腺细胞可塑性的调控机制实验室前期研究通过对5个月斑马鱼成熟的性腺进行了miRNA和mRNA深度测序分析,筛选到许多性别相关的差异表达miRNA和GPCR基因。本课题结合显微注射和定量PCR分析进一步筛选出四个特异的miRNAs:miR430a,miR218a,miR734,miR141。为了探索特异的miRNAs和Sox9基因之间的相互关系,我们将特异的miRNAs注射到斑马鱼的性腺中,发现注射miR430a能提高精巢中Sox9a基因的表达,而注射miR218a能提高卵巢中Sox9b的表达。过表达Sox9a和Sox9b能够提高精巢和卵巢miR430a前体和miR218a前体的表达。同时发现敲降Sox9a和Sox9b能够分别降低精巢中miR430a前体的表达和卵巢中miR218a前体的表达。以上结果提示miR430a-Sox9a通路偏向调控精巢的发育,而miR218a-Sox9b通路偏向卵巢的发育。为了研究上述调控通路对精巢发育和卵泡生成的影响,我们在新近成熟斑马鱼性腺内分别注射特异miRNA和Sox9混合物。结果发现Sox9a-miR430a混合物能够提高染色体浓缩细胞和未分化的精原细胞的比例;而Sox9b-miR218a混合物能够诱导卵泡新生,降低精巢中染色体浓缩细胞和精子细胞的比例。当miRNA-Sox9混合物注射到2两年龄斑马鱼性腺内,发现Sox9a-miR430a能够明显的提高染色体浓缩细胞和未分化的精原细胞的比例,而Sox9b-miR218a能够诱导卵泡新生。我们又将miRNASox9混合物注射到vasa-GFP转基因青鳉鱼的性腺内,发现miR430a-Sox9a能够提高精巢中荧光报告信号,而miR218a-Sox9b能够增强卵巢中荧光报告信号。这些结果表明miR430a-Sox9a协同调节精巢的发育,而miR218a-Sox9b能够促进卵泡的更新。通过Pmir-GFP荧光酶报告实验检验miR430a和miR218a与Gpr157,Grk5l,Grk4,Lgr4的靶向关系,结果显示miR430a靶向Lgr4,Grk5l,Grk4,而miR218a靶向Gpr157,Grk5l,Grk4。说明miRNA可能通过GPCR调节Sox9a和Sox9b的活性。免疫沉淀(IP)-质谱分析发现注射miR430a和miR218a能分别影响Sox9a和Sox9b蛋白的磷酸化和乙酰化修饰等,同时发现一些酶可能与Sox9a/Sox9b蛋白的磷酸化和乙酰化等修饰有关,包括PI3K,ROCK,PKC等。体内体外免疫印迹实验进一步验证混合注射miR430a/miR218a能分别Sox9a和Sox9b蛋白的条带大小。根据以上结果我们推测miRNA可能通过GPCR调节网络影响Sox9a/Sox9b蛋白的翻译后修饰。实验发现注射Sox9a能够提高精巢中p-PKC的表达水平,而共注射miR430a-Sox9a混合物能够同时提高p-PKC/p-Akt的活性。在卵巢中,Sox9b能够提高p-PKCc的活性,但是共注射miR218a能抑制p-PKC和p-Akt的活性。更惊奇发现敲降精巢中lgr4,grk5l,grk4能够很明显的降低p-PKC,p-Akt的磷酸化水平。然而在卵巢中敲降gpr157,grk5l,grk4能够促进p-PKC的表达降低P-Akt的表达。同时免疫组化更加清晰的发现共注射Sox9a和miR430a能够提高精巢中p-PKC和p-Akt的表达,而miR218a和Sox9b能够抑制p-PKC和p-Akt蛋白的表达。2.组蛋白修饰对斑马鱼心脏再生过程中细胞可塑性的影响我们前期实验显示斑马鱼心尖剪切后心脏再生过程包括炎性增生、血管重建和肌肉再生,分别以α-acta2,flk1和pax3a基因表达为代表。本实验首先利用染色体免疫共沉淀高通量测序分析结合转录组测序分析鉴定了斑马鱼心脏再生过程中57个基因的组蛋白H3K9ac修饰水平和转录水平同步增高。同时发现与心血管生成,细胞外基质,细胞骨架,细胞分化等关键基因Flk1,α-acta2,pax3a及其周围相邻基因在斑马鱼心脏再生过程中乙酰化水平明显升高,甲基化水平显著降低。显微注射H3K9ac和H3K9me3修饰抑制剂,发现抑制组蛋白H3K9ac影响斑马鱼心脏再生过程胶原组织的形成,同时也抑制血管芽基和芽基组织的形成。斑马鱼心脏再生过程中H3K9me3修饰受到抑制后,有详细结果显示胶原生产过度生成,芽基组织的形成受到抑制。同时体外抑制斑马鱼胚胎成纤维细胞(Pac2)细胞组蛋白H3K9ac和H3K9me3修饰会影响成纤维细胞的细胞骨架。总之,我们的研究发现miR430a/mirR218a能够分别通过调节GPCR,调控p-PKC/p-Akt的活性,从而提高Sox9a和Sox9b的活性。其中miR430a-Sox9a协同调节精巢的发育,而miR218a-Sox9b能够促进卵泡的更新。同时我们发现组蛋白H3K9ac和H3K9me3修饰反向调节α-acta2,flk1和pax3a的表达,影响斑马鱼心脏再生过程中芽基组织的生成和芽基细胞的可塑性改变。研究miRNA和组蛋白修饰调控斑马鱼组织再生过程中可塑性的分子机制可为再生医学提供新的思路。