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吉富罗非鱼（GIFT strain Oreochromis niloticu）是由尼罗罗非鱼改良而成的新品种[1],具有生长速度快、出肉率高和易捕捞等优点,目前是我国罗非鱼（Oreochromis spp）养殖的主导品种。由于养殖模式和养殖环境的改变,罗非鱼无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）病频发,该病已成为制约产业可持续发展的瓶颈。因此,亟需要弄清楚吉富罗非鱼感染无乳链球菌后的免疫应答反应,挖掘出抗无乳链球菌病关键基因,为后续通过分子标记辅助选育或基因编辑方法培育出抗病新品种提供技术支撑。在此背景下,本文拟通过构建吉富罗非鱼家系,采用人工感染无乳链球菌和检测肝脏免疫相关酶活性的方法,筛选出高抗病家系和易感病家系,再对两个家系鱼的脾脏组织进行转录组和蛋白质组测序,联合分析筛选出抗病候选基因并进行验证。实验结果如下:1.吉富罗非鱼家系的构建及抗无乳链球菌感染能力的评估按雌雄鱼1:1配对,构建吉富罗非鱼家系53个,采用人工腹腔注射方式感染无乳链球菌,根据感染后家系的存活率和死亡时间评估其抗感染能力。结果发现,感染存活率在90%以上的家系有12个,在70%～89%有14个,在30%～69%有19个,低于30%有8个。将存活率在90%以上的12个家系定义为高抗病家系,感染存活率低于30%的8个家系定义为易感病家系;对高抗病家系和易感病家系肝脏的SOD、AKP、LZM和T-AOC酶活性检测发现,在无乳链球菌感染早期这4种酶活性在高抗病家系中均表达上调,而在易感病家系则表达下调,进一步验证了人工感染试验结果的可靠性。2.吉富罗非鱼不同抗病性家系感染无乳链球菌后脾脏转录组差异分析对吉富罗非鱼高抗病家系和易感病家系感染无乳链球菌后4个时期（感染前、5 h、50h和7 d）的脾脏进行测序。在高抗病家系与易感病家系之间共发现5756个差异表达基因,其中在感染后5h最多为4937个。功能注释这些差异表达基因,发现高抗病家系在病原识别、抗原提呈、免疫激活等方面表现出较强的能力,而在易感病家系中则表现出较快的凋亡激活能力。从差异表达基因中筛选出 Cathepsin、chemokine、Integrin、Interleukin、Lysozyme C、MHC、Galectin等基因可能与吉富罗罗非鱼抗无乳链球菌感染相关。3.吉富罗非鱼不同抗病性家系感染无乳链球菌后脾脏蛋白质组差异分析采用iTRAQ技术比较了高抗病家系和易感病家系感染无乳链球菌后4个时期（感染前、5 h、50 h和7 d）脾脏蛋白质的表达差异。共鉴定到1607种蛋白质,其中在感染前两个家系间共鉴定173种表达显著差异的蛋白质,其中上调蛋白质105个,下调68个,在感染后5h有108个蛋白质上调,下调75个。转录组和蛋白质组联合分析发现,无乳链球菌感染后5h和50h,分别有24个和41个差异表达基因的转录和蛋白质表达模式一样,其功能主要涉及到细胞骨架形成、囊泡转运、翻译后修饰、核酸转运和代谢、免疫应答等,其中 Cathepsin B、Galectin-3、MHC class I、CC chemokine、Complement C1r等基因可能是吉富罗非鱼抗无乳链球菌病的候选基因。4.抗病候选基因cathepsin B基因的克隆及免疫应答分析从转录组数据库得到吉富罗非鱼cathepsin B基因的部分序列,采用RACE法扩增得到其cDNA序列全长为1746bp,其中5’端非编码区（5’UTR）长161bp,3’端非编码区（3’UTR）592bp,开放阅读序列（ORF）大小为993bp,共编码331个氨基酸。组织表达谱显示,cathepsin B基因在健康鱼的8种组织中均有表达,其中鳃表达量最高,其次是脾脏和肠道。高抗病家系与易感病家系感染无乳链球菌后5h和50h cathepsin B基因在脾脏、肾脏和肠道中的表达量均显著上调,且高抗病家系在同时期和组织的表达上调量显著高于易感病家系（P<0.05）。以上结果表明,cathepsin B基因在吉富罗非鱼的免疫应答反应中发挥了重要作用。5.抗病候选基因galectin-3基因的克隆及免疫应答分析从转录组数据库中得到吉富罗非鱼galectin-3基因的部分序列,采用RACE法扩增得到其cDNA序列全长全长为1034 bp,包含182 bp 5’未翻译区域（UTR）、162 bp 3’未翻译区域（UTR）以及690 bp开放式阅读框（ORF）,包含5个外显子和4个内含子,其编码了 229个氨基酸残基（aa）,预测其分子量为24.81kDa,等电点（PI）为7.98。将该基因开放式阅读框信息上传到GenBank数据库中（Gen Bank登记号:NC031983.1）。组织表达谱显示,galectin-3基因在健康鱼10种组织中均有表达,其中脾脏和前肾的表达量最高。无乳链球菌感染后肠、肝脏、脾脏、前肾和鳃的表达量均比感染前显著上调,其中脾脏、前肾和鳃在感染后5h的表达量最高,肠为50h,肝脏为7d;嗜水气单胞菌胁迫感染后肠、肝脏、脾脏、前肾和鳃的表达量也呈现先上调后下调趋势,其中肠、肝脏和鳃的表达峰值为感染后18h,前肾为12h,脾脏为36h。以上结果表明,galectin-3基因在吉富罗非鱼免的疫应答反应中也发挥了重要作用。综上所述,本研究成功筛选出了吉富罗非鱼高抗病家系和易感病家系,完成了两种不同抗病性家系感染无乳链球菌后脾脏的转录组和蛋白质组差异分析,分别从基因水平和蛋白质水平揭示了吉富罗非鱼抗无乳链球菌感染的免疫应答机制。初步确定cathepsin B基因和galectin3基因为吉富罗非鱼抗无乳链球菌病基因。研究结果为吉富罗非鱼抗病分子标记辅助选育及疫苗研发提供了理论基础。