G蛋白偶联受体GPR41在人、小鼠及大鼠等物种间的氨基酸序列高度保守,在体内分布广泛。因为其配体未知所以一直被归为孤儿GPCR,直到2003年发现其配体为短链脂肪酸。该受体的去孤儿化促使人们重新估量游离脂肪酸发挥作用的机制以及研究该受体在健康和疾病过程中扮演的角色。在发现短链脂肪酸是GPR41的配体之前,人们已经发现短链脂肪酸是组蛋白去乙酰化酶的抑制剂,通过调控组蛋白乙酰化状态来调控基因表达。已有研究表明组蛋白乙酰化修饰异常引发人类疾病主要是由于重塑复合物中的关键蛋白发生突变,影响基因的正常表达而引发人类疾病。组蛋白的乙酰化修饰在转录调控中的作用近年来成为表观遗传学研究的热点。丁酸钠作为组蛋白去乙酰化酶的抑制剂,能够参与调控细胞增殖与分化、细胞凋亡、周期阻滞等生物学功能,在真核生物基因表达调控中起着很重要的作用。丁酸钠既能作为G蛋白偶联受体GPR41的激动剂,又能作为组蛋白去乙酰化酶的抑制剂,这一现象提示我们GPR41的激活可能参与组蛋白乙酰化修饰,并与调节基因表达有关。目前有关GPR41受体激动剂和该受体发挥作用的机制还未完全清楚。本实验利用PCR、酶切、连接等分子生物学手段和细胞培养、细胞转染等细胞生物学手段构建了GPR41受体稳定细胞株。建立了cAMP检测和钙流检测等第二信使检测方法,用于筛选GPR41受体的激动剂。利用流式细胞术和Western Blot等方法分析GPR41在丁酸钠引起的组蛋白乙酰化修饰调节中发挥的作用。1.人源G蛋白偶联受体GPR41稳定细胞株的建立本实验的目的是建立人源GPR41受体的稳定细胞株,利用其筛选hGPR41受体潜在的激动剂。因此克隆并构建hGPR41受体基因是进行本课题研究的前提条件,本文首先利用PCR技术从人基因组DNA中克隆出全长的GPR41序列,运用酶切、连接、转化等基因工程技术,将PCR产物插入真核表达载体pcDNA3.1-N-myc中,构建了GPR41-pcDNA3.1真核表达质粒。经酶切和测序鉴定,证明所构建的真核表达质粒正确。将该表达质粒单转或与Ga共转染CHO细胞,通过抗生素筛选,建立稳定的GPR41-CHO或G41-Gα-CHO受体细胞株。利用实时定量PCR和Western Blot的方法在分子和蛋白水平上检测GPR41的表达；利用cAMP及钙流变化来检测细胞株的活性。实验结果表明,丁酸钠作用于GPR41-CHO稳定细胞株可以降低细胞内cAMP水平；丁酸钠作用于G41-Ga-CHO受体细胞株会引起细胞内钙流变化。实验结果证明GPR41稳定细胞株构建成功,该细胞株可以用于筛选受体激动剂和进行相关的活性分析。2.GPR41受体激动剂的初步筛选在海洋生物资源中,海洋真菌因其种类繁多、分布广泛、次级代谢产物量大、生物活性物质种类丰富,成为开发海洋药物资源的重要内容。我们将从福建莆田平海湾海藻来源的黄曲霉c-f-3中提取的次级代谢产物,利用cAMP测试法对选送的单体化合物进行了受体结合活性的初步测定。我们利用GPR41受体细胞株,采用cAMP的方法检测100nM,1μM,10μM三种浓度的小分子化合物。比较各种化合物引起GPR41受体细胞株cAMP水平变化的程度。根据初筛结果,进行复筛。实验结果表明,编号37号的化合物具有GPR41受体激动活性,并且该化合物活性较高。通过结构解析发现,37号化合物是一种新的化合物,属于2-吡喃酮类化合物。试验中我们还发现17号化合物在多种细胞中均能够引起cAMP水平的增加,推测17号化合物可能是磷酸二酯酶的抑制剂。3.GPR41对组蛋白乙酰化修饰相关基因表达的影响组蛋白的乙酰化修饰异常引发人类疾病,主要是由于重塑复合物中的关键蛋白发生突变,影响基因的正常表达引发人类疾病。组蛋白的乙酰化修饰在转录调控中的作用近年来成为表观遗传学的研究热点。短链脂肪酸可以通过改变组蛋白乙酰化状态来调控基因表达,并参与调控细胞增殖与分化、细胞凋亡、周期阻滞等生物学功能,在真核生物基因表达调控中起着很重要的作用。短链脂肪酸既能作为G蛋白偶联受体的激动剂,又能作为组蛋白去乙酰化酶的抑制剂,这一现象提示我们GPR41的激活可能与组蛋白乙酰化修饰有关。本实验利用流式细胞术和Western方法研究GPR41在丁酸钠调节组蛋白乙酰化修饰过程中发挥的作用。实验结果表明GPR41的激活能够抵御丁酸钠引起的细胞活力降低,减少细胞凋亡增加,并能够影响细胞周期分布。4.利用cAMP筛选突变重组人胰高血糖素样肽-1及活性分析胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide1, GLP-1)及其长效类似物具有神经保护和神经营养作用,在治疗神经退行性疾病方面有较大的应用潜力。但GLP-1的半衰期短,限制了其在临床上的应用。在前期工作中,我们利用基因重组技术获得了突变型人GLP-1,本实验利用cAMP检测方法检验其是否能够激活GLP-1受体,并且观察了mGLP-1诱导PC12细胞分化的作用。结果显示mGLP-1可以激活GLP-1受体,引起cAMP水平的增加,并能诱导PC12细胞神经样分化、增加神经元信号分子生长相关蛋白43和Ⅲ型微管蛋白β的表达。结果表明mGLP-1能激活GLP-1受体,诱导PC12细胞分化,具有神经营养的生物学活性。