单分子测定(Single-Molecule Detection,SMD)是近年来迅速发展起来的一种超高灵敏的检测技术,在分析化学、生命医学、流体力学、药学等领域得到了极为广泛的应用。与传统的检测技术(如分光光度法、化学发光法等)相比,SMD能够实现单分子水平上的检测,在化学生物分析和疾病早期诊断领域展现出巨大的发展潜力。本论文瞄准这一研究领域,搭建了国内首套基于光纤微阵列的单分子检测平台,以催化酶和底物的反应为研究体系,从单分子水平上对酶分子进行了测定。具体研究工作如下:(1)单分子检测平台的搭建。根据论文的工作设计和安排,我们首先基于高密度光纤微阵列和荧光显微镜系统,搭建了单分子检测平台。论文主要探究了该装置的搭建思路和过程,包括暗室环境的改造,显微镜上机械平台和相关配件的设计、加工和安装,以及Z轴升降台和倾斜载物台的组装,为从单分子水平上对酶分子进行测定奠定了基础。(2)基于所搭建的单分子检测平台,结合泊松分布理论,设计低浓度的酶和相应底物在检测平台上反应,用以对该平台进行调试并分析了其对单分子进行检测的可行性。利用调试好的单分子检测平台,结合光纤微阵列,以β-半乳糖苷酶和试卤灵-D-β-吡喃半乳糖苷为研究对象,分析了数字化信号和酶浓度之间的定量关系,证明了酶分子在低浓度下,可以通过数字阵列的方式展现出来,最终实现了对单个酶分子的超高灵敏测定。(3)在上述研究工作的基础上,本论文通过对磁珠表面进行生物素化修饰,基于生物素和链霉亲和素之间的亲和作用,利用所搭建的单分子检测平台,对链霉亲和素标记的单个酶分子进行了测定。在该实验实施的过程中,对实验条件分别进行了优化:探究了羧基化磁珠的活化过程;考察了活化磁珠与BSA偶联过程中的结合率;优化了磁珠表面BSA生物素化过程中的生物素量并计算了相应的生物素化率;探究了磁珠进入光纤微孔的方式并优化了进入微孔的磁珠量。该技术为进一步将所搭建的单分子检测平台用于抗原抗体等生物大分子的超高灵敏测定奠定了基础。