铁是机体生长所必须的营养元素，在畜牧生产中，通常采取给仔猪补铁的方式预防其缺铁。近年来，感染性疾病成为畜牧养殖业又一难题，主要由肠道致病性微生物所引起。同时，铁也是致病微生物增殖和发挥毒力的重要元素，因此，在给仔猪补铁时常常会面临加重感染的风险。早期研究发现，机体发生感染时，病原微生物会分泌一种名为铁载体的物质，从机体的铁-蛋白复合物中获得铁，而脂质运载蛋白2(Lipocalin2，Lcn2)能够与铁载体结合从而阻止细菌获铁。Lcn2是机体先天免疫系统的重要组成部分，广泛参与多种生命过程，包括免疫反应、铁代谢、炎症反应以及细胞迁移、增殖、分化与凋亡等。近年来的研究显示，除了限制细菌获铁，Lcn2在机体先天性免疫中也发挥着一定的作用，但具体机制不明。Lcn2除了结合铁载体，还能通过其他什么途径协助机体对抗细菌感染？Lcn2作为中性粒细胞的二级颗粒蛋白，是否对包括中性粒细胞在内的免疫细胞作用产生影响？这些都有待进一步研究。　　本研究通过探究Lcn2在野生型小鼠正常机体内的分布，以及肠出血性大肠杆菌EHEC O157∶H7感染后机体各组织不同时间点Lcn2表达的改变，阐述了其在机体感染中的作用;利用敲除小鼠模型，探究了机体内Lcn2的抑菌特性并进一步揭示了其对机体巨噬细胞和中性粒细胞作用的影响。主要研究内容如下:　　试验一:Lcn2的时空表达特异性　　本实验分别研究了Lcn2在机体正常条件下与EHEC O157∶H7感染条件下的表达特异性。结果显示:在正常条件下，Lcn2主要表达于小鼠骨髓、白色脂肪组织、肺、脾脏中，在骨髓中表达量最高，而在肝脏、肾脏、肌肉等组织中表达较低，其中，Lcn2在骨髓中的表达量可以达到肾脏组织中的3000倍左右。在EHECO157∶H7感染条件下，①小鼠肝脏、肾脏、肺、脾脏、空肠、结肠中的Lcn2表达显著升高(P＜0.01)，其中肝脏中Lcn2的表达量升高最明显，升高倍数可以达到感染前的300倍左右;②小鼠肝脏、肾脏、脾脏、空肠中的Lcn2表达量在32h处迅速达到最高(P＜0.01);③血清中Lcn2蛋白含量为升高趋势，在24h达到极显著（P＜0.01），并在32h处达到最高（P＜0.01）。以上结果表明，EHECO157∶H7感染能够显著提高小鼠机体内多种组织以及血液中Lcn2的表达，提示其可能参与细菌的感染过程与机体的免疫过程。　　试验二:Lcn2的抑菌特性　　试验一结果显示，当小鼠受到EHEC O157∶H7感染时，机体内多种组织以及血液中Lcn2的表达显著升高，我们推测其参与机体的免疫过程，那么在这个过程中，Lcn2对EHEC O157∶H7的生长是否有影响？本实验通过建立野生型小鼠与Lcn2敲除小鼠（Lcn2-/-小鼠）的EHEC O157∶H7感染模型，研究了Lcn2在体内的抑菌作用。结果表明，Lcn2-/-小鼠的血液与肝脏中EHEC O157∶H7细菌数目显著高于野生型小鼠(P＜0.05)。其中，Lcn2-/-小鼠血液中的细菌数较野生型小鼠增长了近10倍，肝脏中的细菌数较野生型小鼠增长了近100倍。这说明Lcn2缺失有利于细菌在小鼠体内的生长和增殖。为了探究Lcn2是否具有直接的抑菌作用，本实验进一步通过建立野生型与Lcn2-/-小鼠炎症模型，利用炎症急性反应期血清培养EHEC O157∶H7。结果表明，用Lcn2-/-小鼠血清配制的培养基中细菌数也显著高于野生型小鼠(P＜0.05)。由于在炎症条件下，Lcn2在野生型小鼠中大量表达，我们推测血清的抑菌效果可能与Lcn2有关。与此同时，我们还考察了Lcn2对机体炎症因子表达的影响。结果发现相较于野生型小鼠，在Lcn2-/-小鼠炎症模型中，Lcn2缺失显著降低了肝脏中TNF-α、IL-10、MCP-1以及MIP-2的表达(P＜0.05)，外周血与腹腔液中的TNF-α水平同样受到了抑制（P＜0.05）。这暗示着Lcn2-/-小鼠中EHEC O157∶H7细菌在体内的高承载量可能与其机体炎症因子的低表达量有关。综上所述，Lcn2缺失能促进EHEC O157∶H7细菌在体内的生长繁殖，同时扰乱机体在受到病原菌刺激后分泌炎性细胞因子的正常功能，推测Lcn2一方面具有一定的直接抑菌作用，另一方面还可能与机体的免疫细胞功能息息相关。　　试验三:Lcn2对免疫细胞功能的影响　　本实验研究了Lcn2对中性粒细胞和巨噬细胞的作用。对中性粒细胞及其功能进行研究，通过吉姆萨染色外周血涂片观察发现，Lcn2-/-小鼠外周血中不成熟的杆状细胞数显著高于野生型小鼠（P＜0.05）;流式细胞仪结果显示，Lcn2-/-小鼠外周血中性粒细胞数显著低于野生型小鼠（P＜0.05）;用流式细胞仪检测炎症刺激后小鼠腹腔液与血液中性粒细胞占比，发现Lcn2-/-小鼠外周血中性粒细胞的占比相较于野生型有更高的趋势，而腹腔液中性粒细胞占比较野生型显著降低（P＜0.05）。对巨噬细胞相关功能进行研究，通过LPS诱导建立小鼠巨噬细胞炎症模型，研究外源重组Lcn2对LPS诱导下巨噬细胞分泌炎症因子的影响，结果发现，Lcn2显著降低TNF-α、IL-6、GM-CSF、iNOS、MIP-2与KC的表达(P＜0.05)，而IL-10表达显著升高(P＜0.05);此外，Lcn2能够显著促进巨噬细胞的吞噬作用（P＜0.01）与迁移。以上结果表明，Lcn2能够维持中性粒细胞的成熟与稳态，并能提高其迁移能力;另一方面，外源重组Lcn2能够缓解LPS所诱导的巨噬细胞炎症反应，同时促进其吞噬和迁移作用。　　综上所述，EHEC O157∶H7感染能够显著提高小鼠机体内肝脏、肾脏、肺、脾脏、空肠、结肠以及血液中Lcn2基因与蛋白的表达，在灌胃染菌后第32h小鼠血液与组织中Lcn2的含量达到最高。Lcn2缺失能促进EHEC O157∶H7细菌在体内的生长繁殖，同时扰乱机体在受到病原菌刺激后分泌炎性细胞因子的正常功能。对中性粒细胞及其功能进行研究发现，Lcn2能够维持中性粒细胞的成熟与稳态，并能提高其迁移能力;对巨噬细胞相关功能进行研究发现，外源重组Lcn2能够缓解LPS所诱导的巨噬细胞炎症反应，同时促进其吞噬和迁移作用。以上结果说明，当机体受到感染时，Lcn2通过维持与调节免疫细胞的作用抑制EHECO157∶H7生长，保护机体避免损伤。